Рутинный сбор наборов крио-ЭМ данных высокого разрешения с использованием просвечивающего электронного микроскопа 200 кВ

Криоэлектронная микроскопия (крио-ЭМ) была создана в качестве рутинного метода определения структуры белка в течение последнего десятилетия, занимая все большую долю опубликованных структурных данных. Последние достижения в области технологий и автоматизации ТЕА повысили как скорость сбора данных, так и качество получаемых изображений, одновременно снижая требуемый уровень знаний для получения крио-ЭМ-карт с разрешением ниже 3 Å. В то время как большинство таких структур с высоким разрешением были получены с использованием современных крио-ТЕА 300 кВ, структуры высокого разрешения могут быть также получены с помощью крио-ТЕА-систем 200 кВ, особенно при оснащении энергетическим фильтром. Кроме того, автоматизация выравнивания микроскопов и сбора данных с оценкой качества изображения в режиме реального времени снижает сложность системы и обеспечивает оптимальные настройки микроскопа, что приводит к увеличению выхода высококачественных изображений и общей пропускной способности сбора данных. Этот протокол демонстрирует реализацию последних технологических достижений и функций автоматизации на электронном микроскопе криопропускания 200 кВ и показывает, как собирать данные для реконструкции 3D-карт, достаточных для построения атомной модели de novo . Мы фокусируемся на лучших практиках, критических переменных и общих проблемах, которые необходимо учитывать, чтобы обеспечить рутинный сбор таких наборов крио-ЭМ с высоким разрешением. В частности, подробно рассматриваются следующие важные темы: i) автоматизация выравнивания микроскопов, ii) выбор подходящих областей для сбора данных, iii) оптимальные оптические параметры для высококачественного, высокопроизводительного сбора данных, iv) настройка энергетического фильтра для визуализации с нулевыми потерями и v) управление данными и оценка качества. Применение лучших практик и улучшение достижимого разрешения с помощью энергетического фильтра будет продемонстрировано на примере апо-ферритина, который был реконструирован до 1,6 Å, и протеасомы Thermoplasma acidophilum 20S, реконструированной до разрешения 2,1-Å с использованием ТЭМ 200 кВ, оснащенного энергетическим фильтром и прямым электронным детектором.