Recopilación rutinaria de conjuntos de datos crio-EM de alta resolución utilizando un microscopio electrónico de transmisión de 200 KV

La microscopía crioelectrónica (crio-EM) se ha establecido como un método de rutina para la determinación de la estructura de proteínas durante la última década, tomando una parte cada vez mayor de los datos estructurales publicados. Los recientes avances en la tecnología TEM y la automatización han aumentado tanto la velocidad de recopilación de datos como la calidad de las imágenes adquiridas, al tiempo que disminuyen el nivel requerido de experiencia para obtener mapas crio-EM a resoluciones inferiores a 3 Å. Si bien la mayoría de estas estructuras de alta resolución se han obtenido utilizando sistemas crio-TEM de 300 kV de última generación, las estructuras de alta resolución también se pueden obtener con sistemas crio-TEM de 200 kV, especialmente cuando están equipadas con un filtro de energía. Además, la automatización de las alineaciones del microscopio y la recopilación de datos con la evaluación de la calidad de la imagen en tiempo real reduce la complejidad del sistema y garantiza una configuración óptima del microscopio, lo que resulta en un mayor rendimiento de imágenes de alta calidad y un rendimiento general de la recopilación de datos. Este protocolo demuestra la implementación de los recientes avances tecnológicos y características de automatización en un microscopio electrónico de criotransmisión de 200 kV y muestra cómo recopilar datos para la reconstrucción de mapas 3D que son suficientes para la construcción de modelos atómicos de novo . Nos centramos en las mejores prácticas, las variables críticas y los problemas comunes que deben considerarse para permitir la recopilación rutinaria de dichos conjuntos de datos crio-EM de alta resolución. En particular, se revisan en detalle los siguientes temas esenciales: i) automatización de alineaciones de microscopios, ii) selección de áreas adecuadas para la adquisición de datos, iii) parámetros ópticos óptimos para la recopilación de datos de alta calidad y alto rendimiento, iv) ajuste del filtro de energía para imágenes de pérdida cero, y v) gestión de datos y evaluación de calidad. La aplicación de las mejores prácticas y la mejora de la resolución alcanzable utilizando un filtro de energía se demostrará en el ejemplo de apo-ferritina que se reconstruyó a 1,6 Å, y thermoplasma acidophilum 20S proteasoma reconstruido a resolución 2,1-Å utilizando un TEM de 200 kV equipado con un filtro de energía y un detector de electrones directo.