Rutinmässig insamling av högupplösta kryo-EM-dataset med 200 KV transmissionselektronmikroskop

Kryoelektronmikroskopi (kryo-EM) har etablerats som en rutinmässig metod för bestämning av proteinstruktur under det senaste decenniet och tar en ständigt ökande andel av publicerade strukturdata. De senaste framstegen inom TEM-teknik och automatisering har ökat både hastigheten på datainsamlingen och kvaliteten på förvärvade bilder samtidigt som den minskar den nödvändiga kompetensnivån för att erhålla kryo-EM-kartor vid sub-3 Å-upplösningar. Medan de flesta av sådana högupplösta strukturer har erhållits med hjälp av toppmoderna 300 kV kryo-TEM-system, kan högupplösta strukturer också erhållas med 200 kV kryo-TEM-system, särskilt när de är utrustade med ett energifilter. Dessutom minskar automatiseringen av mikroskopjusteringar och datainsamling med bedömning av bildkvalitet i realtid systemets komplexitet och säkerställer optimala mikroskopinställningar, vilket resulterar i ökat utbyte av högkvalitativa bilder och övergripande genomströmning av datainsamling. Detta protokoll visar implementeringen av de senaste tekniska framstegen och automatiseringsfunktionerna på ett 200 kV kryoöverföringselektronmikroskop och visar hur man samlar in data för rekonstruktion av 3D-kartor som är tillräckliga för de novo atommodellbyggnad. Vi fokuserar på bästa praxis, kritiska variabler och vanliga problem som måste beaktas för att möjliggöra rutinmässig insamling av sådana högupplösta kryo-EM-dataset. Särskilt följande viktiga ämnen granskas i detalj: i) automatisering av mikroskopinriktningar, ii) val av lämpliga områden för datainsamling, iii) optimala optiska parametrar för datainsamling av hög kvalitet, hög genomströmning, iv) energifilterjustering för nollförlustavbildning och v) datahantering och kvalitetsbedömning. Tillämpning av bästa praxis och förbättring av uppnåelig upplösning med hjälp av ett energifilter kommer att demonstreras på exemplet apo-ferritin som rekonstruerades till 1,6 Å och Thermoplasma acidophilum 20S proteasom rekonstruerad till 2,1-Å upplösning med hjälp av en 200 kV TEM utrustad med ett energifilter och en direktelektrondetektor.