Microdissection en couche des feuillets de valve tricuspide pour la caractérisation mécanique biaxiale et la quantification microstructurale

Résumé

Ce protocole décrit la caractérisation mécanique biaxiale, la quantification du collagène basée sur l’imagerie du domaine de fréquence spatiale polarisée et la microdissection des feuillets de valve tricuspide. La méthode fournie explique comment les couches de la foliole contribuent aux comportements holistiques de la feuille.

Résumé

La valve tricuspide (TV) régule le flux unidirectionnel de sang non oxygéné de l’oreillette droite vers le ventricule droit. Le téléviseur se compose de trois dépliants, chacun avec des comportements mécaniques uniques. Ces variations entre les trois feuillets de télévision peuvent être mieux comprises en examinant leurs quatre couches anatomiques, qui sont l’atrialis (A), le spongiosa (S), la fibrose (F) et le ventriculaire (V). Bien que ces couches soient présentes dans les trois feuillets de télévision, il existe des différences dans leurs épaisseurs et leurs constituants microstructuraux qui influencent davantage leurs comportements mécaniques respectifs.

Ce protocole comprend quatre étapes pour élucider les différences spécifiques à la couche: (i) caractériser les comportements architecturaux mécaniques et des fibres de collagène de la feuille de télévision intacte, (ii) séparer les couches composites (A / S et F / V) de la feuille de télévision, (iii) effectuer les mêmes caractérisations pour les couches composites et (iv) effectuer des couches post-hoc évaluation histologique. Ce cadre expérimental permet de manière unique la comparaison directe du tissu TV intact à chacune de ses couches composites. En conséquence, des informations détaillées concernant la microstructure et la fonction biomécanique des feuillets de télévision peuvent être collectées avec ce protocole. Ces informations peuvent potentiellement être utilisées pour développer des modèles informatiques de télévision qui cherchent à fournir des conseils pour le traitement clinique de la maladie de la télévision.

Introduction

Le téléviseur est situé entre l’oreillette droite et le ventricule droit du cœur. Tout au long du cycle cardiaque, le téléviseur régule le flux sanguin unidirectionnel par l’ouverture et la fermeture cycliques de la feuillet antérieure de la télévision (TVAL), de la feuillet postérieure de la télévision (TVPL) et de la feuillet septale de la télévision (TVSL). Ces folioles sont complexes et ont quatre couches anatomiques distinctes – l’atrialis (A), le spongiosa (S), le fibrosa (F) et le ventricularis (V) – avec des constituants microstructuraux uniques. Les fibres d’élastine dans l’atrialis et le ventriculaire aident à restaurer le tissu à sa géométrie non déformée a....

Protocole

Toutes les méthodes décrites dans le présent document ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de l’Oklahoma. Les tissus animaux ont été acquis dans un abattoir approuvé par l’USDA.

1. Caractérisation mécanique biaxiale

1. Préparation des tissus
   1. Récupérez un dépliant TV du congélateur, des lames de rasoir, un stylo chirurgical, une pince, une pipette avec de l’eau désionisée (DI) et un tapis de coupe. Décongelez le dépliant tv en utilisant 2-3 gouttes d’eau DI à température ambiante.
      REMARQUE: L’eau DI est utilisée à la place de la solution salin....

Résultats

La microdissection produira des échantillons A/S et F/V d’épaisseurs relativement uniformes pouvant être montés sur un dispositif d’essai biaxial (commercial). L’analyse histologique de la feuillette intacte et des deux couches disséquées permettra de vérifier si le tissu a été correctement séparé le long de la frontière entre la spongiose et la fibrose (Figure 7). De plus, les micrographies histologiques peuvent être utilisées pour déterminer l’épaisseur de la couche.......

Discussion

Les étapes critiques du protocole comprennent : (i) la microdissection de la couche, (ii) le montage tissulaire, (iii) le placement du marqueur fiducial et (iv) la configuration de l’IDSP. La microdissection de couche appropriée est l’aspect le plus important et le plus difficile de la méthode décrite ici. Avant de lancer une enquête utilisant cette technique, le ou les dissecteurs devraient avoir une pratique à long terme avec la technique de microdissection et les trois dépliants télévisés. Le dissecteur .......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Formalin Solution, Neutral Buffered	Sigma-Aldrich	HT501128-4L
Alconox Detergent	Alconox		cleaning compound
BioTester - Biaxial Tester	CellScale Biomaterials Testing		1.5 N Load Cell Capacity
Cutting Mat	Dahle	B0027RS8DU
Deionized Water	N/A
Fine-Tipped Tool	HTI INSTRUMENTS	NSPLS-12
Forceps - Curved	Scientific Labwares	16122
Forceps - Thick	Scientific Labwares	161001078
Forceps - Thin	Scientific Labwares	16127
LabJoy	CellScale Biomaterials Testing	Version 10.66
Laser Displacement Sensor	Keyence	IL-030
Liquid Cyanoacrylate Glue	Loctite	2436365
MATLAB	MathWorks	Version 2020a
Micro Scissors	HTI Instruments	CAS55C
Pipette	Belmaks	360758081051Y4
Polarized Spatial Frequency Domain Imaging Device	N/A		Made in-house using a digital light projector, linear polarizer, rotating polarizer mount, and charge-coupled device camera. See doi.org/10.1016/j.actbio.2019.11.028 (PMCID: PMC8101699) for more details.
Scalpel	THINKPRICE	TP-SCALPEL-3010
Single Edge Industrial Razor Blades (Surgical Carbon Steel)	VWR International	H3515541105024
Surgical Pen	LabAider	LAB-Skin-6
T-Pins	Business Source	BSN32351
Wax Board	N/A		Made in-house using modeling wax and baking tray
Weigh Boat	Pure Ponta	mdo-azoc-1030