斑马鱼角膜伤口愈合：从磨损到伤口闭合成像分析

该协议的重点是通过磨损破坏斑马鱼的眼表面，以评估细胞水平上随后的伤口闭合。这种方法利用眼毛刺来部分去除角膜上皮，并使用扫描电子显微镜来跟踪伤口闭合过程中细胞形态的变化。

作为眼睛的透明表面，角膜有助于清晰的视力。由于其位置，这种组织容易受到环境侮辱。事实上，临床上最常遇到的眼部损伤是角膜损伤。虽然角膜伤口愈合已经在小型哺乳动物（即小鼠，大鼠和兔子）中进行了广泛的研究，但角膜生理学研究忽略了其他物种，包括斑马鱼，尽管斑马鱼是一种经典的研究模型。

本报告描述了一种对斑马鱼进行角膜擦伤的方法。伤口在 体内 使用眼毛刺在麻醉鱼身上进行。这种方法允许可重复的上皮伤口，使眼睛的其余部分完好无损。擦伤后，在3小时的过程中监测伤口闭合，之后伤口再上皮化。通过使用扫描电子显微镜，然后进行图像处理，可以研究上皮细胞的形状和顶端突起，以研究角膜上皮伤口闭合过程中的各个步骤。

斑马鱼模型的特征允许研究上皮组织生理学和上皮细胞在组织受到挑战时的集体行为。此外，使用剥夺泪膜影响的模型可以产生关于角膜对压力反应的新答案。最后，该模型还允许描绘受物理伤口的任何上皮组织中涉及的细胞和分子事件。该方法可应用于临床前试验中药物有效性的评价。

由于大多数上皮细胞与外部环境接触，它们容易受到身体伤害，因此非常适合研究伤口愈合过程。在经过充分研究的组织中，角膜是研究伤口愈合的细胞和分子方面的一个非常有用的模型。作为一个透明的外表面，它为眼睛提供物理保护，是将光线聚焦到视网膜上的第一个元素。虽然视网膜的结构和细胞组成在物种¹之间不同，但角膜的这些元素在所有相机型眼睛中通常都是相似的，无论物种如何。

角膜由三个主要层^组成2。第一层和最外层是上皮，它不断更新以确保其透明度。第二层是基质，它含有分散的细胞，称为角质细胞，在一层厚厚的严格组织的胶原纤维中。第三层也是最内层是内皮，它允许营养物质和液体从前室扩散到外层。上皮细胞和基质细胞通过生长因子和细胞因子相互作用³。这种相互作用通过上皮损伤后角质细胞的快速凋亡和随后的增殖^4，5而突出。在更深的伤口的情况下，例如穿刺，角质细胞积极参与愈合过程⁶。

与外部环境接触，角膜身体损伤很常见。其中许多是由小异物⁷引起的，例如沙子或灰尘。揉眼的反射可导致广泛的上皮擦伤和角膜重塑

所有实验均获得国家动物实验委员会的批准。

1. 准备工作

1. 提前准备用于麻醉的三卡因储备溶液²⁶ （本方案中使用的0.4%储备溶液）。尽可能戴上手套并将材料放在通风橱中。
   1. 对于50 mL 0.4%溶液，称取200mg三卡因粉末进入50mL管中。将粉末溶解在约45 mL双蒸馏水中。
   2. 用1 M Tris（pH 8.8，〜1.25 mL）将三卡因储备溶液的pH值调节至7。将.......

本研究描述了一种在斑马鱼角膜伤口愈合实验中使用眼部毛刺的方法。该方法从先前对小鼠的研究进行了修改，其中毛刺被证明可以有效地去除上皮细胞层¹³。斑马鱼角膜损伤的挑战包括眼睛的尺寸相对较小，并且在耗时的实验的情况下，需要保持恒定的水流通过鳃（如Xu及其同事所描述的²⁸）。这种方法的主要优点是它的简单性和速度。标准解剖显微镜用于控?.......

角膜物理损伤是眼科患者就诊的最常见原因。因此，建立相关模型以研究角膜病理生理学的不同方面非常重要。到目前为止，小鼠是研究角膜伤口愈合的最常用模型。然而，在鼠伤的眼睛上添加眼药水以验证特定药物对角膜伤口愈合的影响可能很困难。在这方面，斑马鱼模型对于影响角膜伤口愈合的分子的药理学筛选特别有用。这里描述的方法与为鼠标¹³描述的方法非常相似。.......

作者感谢Pertti Panula访问斑马鱼单元，并感谢Henri Koivula对斑马鱼实验的指导和帮助。这项研究得到了芬兰科学院，Jane and Aatos Erkko基金会，芬兰文化基金会和ATIP-Avenir计划的支持。成像在生物技术研究所的电子显微镜部门和光学显微镜部门进行，由HiLIFE和芬兰生物中心支持。