Zebrafisk hornhinde sårheling: Fra slid til sårlukning billeddannelsesanalyse

Denne protokol fokuserer på at beskadige zebrafiskens okulære overflade gennem slid for at vurdere den efterfølgende sårlukning på celleniveau. Denne tilgang udnytter en okulær burr til delvist at fjerne hornhindeepitelet og bruger scanningselektronmikroskopi til at spore ændringer i cellemorfologi under sårlukning.

Som øjets gennemsigtige overflade er hornhinden medvirkende til klart syn. På grund af sin placering er dette væv tilbøjeligt til miljømæssige fornærmelser. Faktisk er de øjenskader, der oftest opstår klinisk, dem til hornhinden. Mens hornhindesårheling er blevet grundigt undersøgt hos små pattedyr (dvs. mus, rotter og kaniner), har hornhindefysiologistudier forsømt andre arter, herunder zebrafisk, på trods af at zebrafisk er en klassisk forskningsmodel.

Denne rapport beskriver en metode til at udføre en hornhinde slid på zebrafisk. Såret udføres in vivo på anæstesiiseret fisk ved hjælp af en okulær burr. Denne metode giver mulighed for et reproducerbart epitelsår, der efterlader resten af øjet intakt. Efter slid overvåges sårlukning i løbet af 3 timer, hvorefter såret reepitheialiseres. Ved hjælp af scanning elektronmikroskopi, efterfulgt af billedbehandling, kan epitelcelleformen og apikale fremspring undersøges for at studere de forskellige trin under hornhindeepitelsårlukning.

Zebrafiskmodellens karakteristika gør det muligt at studere epitelvævets fysiologi og epitelcellernes kollektive opførsel, når vævet udfordres. Desuden kan brugen af en model, der er berøvet tårefilmens indflydelse, give nye svar vedrørende hornhinderespons på stress. Endelig tillader denne model også afgrænsning af de cellulære og molekylære hændelser, der er involveret i ethvert epitelvæv, der udsættes for et fysisk sår. Denne metode kan anvendes til evaluering af lægemiddeleffektivitet i præklinisk testning.

Da de fleste epiteler er i kontakt med det ydre miljø, er de tilbøjelige til fysisk skade, hvilket gør dem velegnede til undersøgelse af sårhelingsprocesser. Blandt de velundersøgte væv er hornhinden en yderst nyttig model i undersøgelsen af de cellulære og molekylære aspekter af sårheling. Som en gennemsigtig ydre overflade giver den fysisk beskyttelse til øjet og er det første element, der fokuserer lyset på nethinden. Mens nethindens struktur og cellesammensætning varierer mellem art¹, er disse elementer i hornhinden generelt ens i alle kamera-type øjne, uanset art.

Hornhinden består af tre hovedlag

Alle forsøg blev godkendt af det nationale dyreforsøgsråd.

1. Præparater

1. Forbered tricain-stamopløsningen, der anvendes til anæstesi²⁶ på forhånd (0,4% stamopløsning anvendt i denne protokol). Brug handsker og opbevar materialerne i en stinkhætte, når det er muligt.
   1. For 50 ml af en 0,4% opløsning vejes 200 mg tricainpulver i et 50 ml rør. Pulveret opløses i ca. 45 ml dobbeltdestilleret vand.
   2. Juster pH-værdien .......

Denne undersøgelse beskriver en metode ved hjælp af en oftalmisk burr i zebrafisk hornhinde sårheling eksperimenter. Metoden er modificeret fra tidligere studier på mus, hvor graten viste sig at fjerne epitelcellelagene effektivt¹³. Udfordringerne ved zebrafisk hornhindesår omfatter øjets relativt lille størrelse og i tilfælde af tidskrævende eksperimenter behovet for at opretholde en konstant vandstrøm gennem gællerne (som beskrevet af Xu og kolleger²⁸). De vigt.......

Hornhinde fysiske skader er den mest almindelige årsag til oftalmologi patientbesøg på hospitalet. Derfor er det vigtigt at etablere relevante modeller til undersøgelse af forskellige aspekter af hornhindepatofysiologi. Indtil videre er musen den mest anvendte model til undersøgelse af hornhindesårheling. Det kan dog være svært at tilføje øjendråber på murine sårede øjne for at validere virkningen af specifikke lægemidler på hornhindesårheling. I den forbindelse er zebrafiskemodellen særlig nyttig til f.......

Forfatterne takker Pertti Panula for adgangen til Zebrafish-enheden og Henri Koivula for vejledning og hjælp til zebrafiskforsøgene. Denne forskning blev støttet af Finlands Akademi, Jane og Aatos Erkko Foundation, den finske kulturfond og ATIP-Avenir-programmet. Billeddannelse blev udført på Electron Microscopy Unit og Light Microscopy Unit, Institute of Biotechnology, støttet af HiLIFE og Biocenter Finland.