Zebrafisch-Hornhautwundheilung: Von der Abrieb- bis zur Wundverschluss-Bildgebungsanalyse

Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Schädigung der Augenoberfläche von Zebrafischen durch Abrieb, um den anschließenden Wundverschluss auf zellulärer Ebene zu beurteilen. Dieser Ansatz nutzt einen Augengrat, um das Hornhautepithel teilweise zu entfernen, und verwendet Rasterelektronenmikroskopie, um Veränderungen in der Zellmorphologie während des Wundverschlusses zu verfolgen.

Als transparente Oberfläche des Auges ist die Hornhaut für eine klare Sicht von entscheidender Bedeutung. Aufgrund seiner Lage ist dieses Gewebe anfällig für Umweltbeleidigungen. In der Tat sind die Augenverletzungen, die klinisch am häufigsten auftreten, die der Hornhaut. Während die Wundheilung der Hornhaut bei kleinen Säugetieren (dh Mäusen, Ratten und Kaninchen) ausführlich untersucht wurde, haben Studien zur Hornhautphysiologie andere Arten, einschließlich Zebrafische, vernachlässigt, obwohl Zebrafische ein klassisches Forschungsmodell sind.

Dieser Bericht beschreibt eine Methode zur Durchführung eines Hornhautabriebs an Zebrafischen. Die Wunde wird in vivo an betäubten Fischen mit einem Augengrat durchgeführt. Diese Methode ermöglicht eine reproduzierbare Epithelwunde, wobei der Rest des Auges intakt bleibt. Nach dem Abrieb wird der Wundverschluss im Laufe von 3 h überwacht, danach wird die Wunde reepithelialisiert. Mit Hilfe der Rasterelektronenmikroskopie, gefolgt von der Bildverarbeitung, können die Epithelzellform und apikale Vorsprünge untersucht werden, um die verschiedenen Schritte während des Hornhautepithel-Wundverschlusses zu untersuchen.

Die Eigenschaften des Zebrafischmodells erlauben es, die Epithelgewebephysiologie und das kollektive Verhalten der Epithelzellen zu untersuchen, wenn das Gewebe herausgefordert wird. Darüber hinaus kann die Verwendung eines Modells, das des Einflusses des Tränenfilms beraubt ist, neue Antworten auf die Reaktion der Hornhaut auf Stress liefern. Schließlich ermöglicht dieses Modell auch die Abgrenzung der zellulären und molekularen Ereignisse, die an jedem Epithelgewebe beteiligt sind, das einer physischen Wunde ausgesetzt ist. Diese Methode kann auf die Bewertung der Arzneimittelwirksamkeit in präklinischen Tests angewendet werden.

Da die meisten Epithel in Kontakt mit der äußeren Umgebung stehen, sind sie anfällig für körperliche Verletzungen, was sie gut für das Studium von Wundheilungsprozessen geeignet macht. Unter den gut untersuchten Geweben ist die Hornhaut ein äußerst nützliches Modell bei der Untersuchung der zellulären und molekularen Aspekte der Wundheilung. Als transparente Außenfläche schützt es das Auge physisch und ist das erste Element, das das Licht auf die Netzhaut fokussiert. Während sich die Struktur und die Zellzusammensetzung der Netzhaut zwischen Spezies¹ unterscheiden, sind diese Elemente der Hornhaut im Allgemeinen in allen kameraartigen Augen ähn....

Alle Experimente wurden vom nationalen Tierversuchsausschuss genehmigt.

1. Vorbereitungen

1. Bereiten Sie die für die Anästhesie verwendete Tricain-Stammlösung²⁶ im Voraus vor (0,4% ige Stammlösung, die in diesem Protokoll verwendet wird). Verwenden Sie Handschuhe und bewahren Sie die Materialien wann immer möglich in einem Abzug auf.
   1. Für 50 ml einer 0,4% igen Lösung wiegen Sie 200 mg Tricainpulver in ein 50-ml-Röhrchen. Lösen Si.......

Diese Studie beschreibt eine Methode mit einem ophthalmologischen Grat in Zebrafisch-Hornhaut-Wundheilungsexperimenten. Die Methode ist modifiziert gegenüber früheren Studien an Mäusen, bei denen gezeigt wurde, dass der Grat die Epithelzellschichten effizient¹³ entfernt. Zu den Herausforderungen bei der Hornhautverletzung von Zebrafischen gehören die relativ geringe Größe des Auges und im Falle zeitaufwendiger Experimente die Notwendigkeit, einen konstanten Wasserfluss durch die Kiemen aufre.......

Hornhautverletzungen sind die häufigste Ursache für ophthalmologische Patientenbesuche im Krankenhaus. Daher ist es wichtig, relevante Modelle für die Untersuchung verschiedener Aspekte der Pathophysiologie der Hornhaut zu erstellen. Bisher ist die Maus das am häufigsten verwendete Modell für das Studium der Hornhautwundheilung. Das Hinzufügen von Augentropfen auf murinen verwundeten Augen, um die Auswirkungen bestimmter Medikamente auf die Wundheilung der Hornhaut zu validieren, kann jedoch schwierig sein. In dies.......

Die Autoren danken Pertti Panula für den Zugang zur Zebrafischeinheit und Henri Koivula für die Anleitung und Hilfe bei den Zebrafischexperimenten. Diese Forschung wurde von der Akademie von Finnland, der Jane und Aatos Erkko Foundation, der Finnish Cultural Foundation und dem ATIP-Avenir-Programm unterstützt. Die Bildgebung wurde an der Elektronenmikroskopie-Einheit und der Light Microscopy Unit, Institute of Biotechnology, durchgeführt, unterstützt von HiLIFE und Biocenter Finland.