Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Biology
Questo protocollo si concentra sul danneggiamento della superficie oculare del pesce zebra attraverso l'abrasione per valutare la successiva chiusura della ferita a livello cellulare. Questo approccio sfrutta una bava oculare per rimuovere parzialmente l'epitelio corneale e utilizza la microscopia elettronica a scansione per tracciare i cambiamenti nella morfologia cellulare durante la chiusura della ferita.
Come la superficie trasparente dell'occhio, la cornea è strumentale per la visione chiara. A causa della sua posizione, questo tessuto è soggetto a insulti ambientali. In effetti, le lesioni oculari più frequentemente riscontrate clinicamente sono quelle alla cornea. Mentre la guarigione delle ferite corneali è stata ampiamente studiata nei piccoli mammiferi (cioè topi, ratti e conigli), gli studi di fisiologia corneale hanno trascurato altre specie, incluso il pesce zebra, nonostante il pesce zebra sia un classico modello di ricerca.
Questo rapporto descrive un metodo per eseguire un'abrasione corneale sul pesce zebra. La ferita viene eseguita in vivo su pesci anestetizzati utilizzando una bava oculare. Questo metodo consente una ferita epiteliale riproducibile, lasciando intatto il resto dell'occhio. Dopo l'abrasione, la chiusura della ferita viene monitorata nel corso di 3 ore, dopo di che la ferita viene rielettileializzata. Utilizzando la microscopia elettronica a scansione, seguita dall'elaborazione delle immagini, la forma della cellula epiteliale e le protrusioni apicali possono essere studiate per studiare i vari passaggi durante la chiusura della ferita epiteliale corneale.
Le caratteristiche del modello zebrafish consentono lo studio della fisiologia del tessuto epiteliale e del comportamento collettivo delle cellule epiteliali quando il tessuto viene sfidato. Inoltre, l'uso di un modello privato dell'influenza del film lacrimale può produrre nuove risposte per quanto riguarda la risposta corneale allo stress. Infine, questo modello permette anche la delineazione degli eventi cellulari e molecolari coinvolti in qualsiasi tessuto epiteliale sottoposto ad una ferita fisica. Questo metodo può essere applicato alla valutazione dell'efficacia del farmaco nei test preclinici.
Poiché la maggior parte degli epiteli sono a contatto con l'ambiente esterno, sono soggetti a lesioni fisiche, rendendoli adatti per lo studio dei processi di guarigione delle ferite. Tra i tessuti ben studiati, la cornea è un modello estremamente utile nello studio degli aspetti cellulari e molecolari della guarigione delle ferite. Come superficie esterna trasparente, fornisce protezione fisica all'occhio ed è il primo elemento a focalizzare la luce sulla retina. Mentre la struttura e la composizione cellulare della retina differiscono tra la specie1, questi elementi della cornea sono generalmente simili in tutti gli occhi di tipo camera, indi....
Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal consiglio nazionale per gli esperimenti sugli animali.
1. Preparativi
Questo studio descrive un metodo che utilizza una bava oftalmica in esperimenti di guarigione delle ferite corneali zebrafish. Il metodo è stato modificato da studi precedenti sui topi, dove la bava ha dimostrato di rimuovere gli strati cellulari epiteliali in modo efficiente13. Le sfide nel ferimento corneale del pesce zebra includono le dimensioni relativamente piccole dell'occhio e, nel caso di esperimenti che richiedono tempo, la necessità di mantenere un flusso d'acqua costante attraverso l.......
Le lesioni fisiche corneali sono la causa più comune di visite dei pazienti oftalmologici in ospedale. Pertanto, è importante stabilire modelli pertinenti per lo studio di diversi aspetti della fisiopatologia corneale. Finora, il topo è il modello più comunemente usato per lo studio della guarigione delle ferite corneali. Tuttavia, l'aggiunta di colliri sugli occhi feriti murini per convalidare l'impatto di farmaci specifici sulla guarigione delle ferite corneali può essere difficile. A questo proposito, il modello .......
Gli autori ringraziano Pertti Panula per l'accesso all'unità Zebrafish e Henri Koivula per la guida e l'aiuto con gli esperimenti di zebrafish. Questa ricerca è stata sostenuta dall'Accademia di Finlandia, dalla Fondazione Jane e Aatos Erkko, dalla Fondazione culturale finlandese e dal programma ATIP-Avenir. L'imaging è stato eseguito presso l'unità di microscopia elettronica e l'unità di microscopia ottica, Istituto di biotecnologia, supportato da HiLIFE e Biocenter Finland.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.1M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4 | in-house | Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4). | |
0.2M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4 | in-house | Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4). | |
0.5mm burr tips | Alger Equipment Company | BU-5S | |
1M Tris, pH 8.8 | in-house | ||
adhesive tabs | Agar Scientific | G3347N | |
Algerbrush burr, Complete instrument | Alger Equipment Company | BR2-5 | |
Cotton swaps | Heinz Herenz Hamburg | 1030128 | |
Dissecting plate | in-house | ||
Dissecting tools | Fine Science Tools | ||
double-distilled water | in-house | ||
Eppedorf tubes, 2ml | any provider | ||
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma | A5040 | Caution: causes irritation. |
Glutaraldehyde, 50% aqueous solution, grade I | Sigma | G7651 | Caution: toxic. |
Lidocaine hydrochloride | Sigma | L5647 | Caution: toxic. |
mounts | Agar Scientific | G301P | |
Petri dish | Thermo Scientific | 101VR20 | |
pH indicator strips | Macherey-Nagel | 92110 | |
Plastic spoons | any provider | ||
Plastic tubes, 15 ml | Greiner Bio-One | 188271 | |
Plastic tubes, 50 ml | Greiner Bio-One | 227261 | |
Scanning electron microscope | FEI | Quanta 250 FEG | |
Soft sponge | any provider | ||
Sputter coater | Quorum Technologies | GQ150TS | |
Stereomicroscope | Leica |
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