ゼブラフィッシュ角膜創傷治癒:擦過傷から創傷閉鎖画像分析まで

このプロトコルは、細胞レベルでのその後の創傷閉鎖を評価するために、擦過傷によってゼブラフィッシュの眼表面を損傷することに焦点を当てている。このアプローチは、眼のバリを利用して角膜上皮を部分的に除去し、走査型電子顕微鏡を使用して創傷閉鎖中の細胞形態の変化を追跡する。

目の透明な表面として、角膜は明確な視力のために役立ちます。その場所のために、この組織は環境侮辱を受けやすいです。実際、臨床的に最も頻繁に遭遇する眼の損傷は、角膜に対するものである。角膜創傷治癒は小型哺乳類(すなわち、マウス、ラット、ウサギ)で広く研究されてきたが、ゼブラフィッシュは古典的な研究モデルであるにもかかわらず、角膜生理学研究はゼブラフィッシュを含む他の種を無視してきた。

この報告は、ゼブラフィッシュに角膜擦過傷を行う方法について記載する。創傷は、眼のバリを用いて麻酔をかけた魚に インビボで 行われる。この方法は、再現性のある上皮創傷を可能にし、眼の残りの部分を無傷のままにする。擦過傷後、創傷閉鎖を3時間にわたって監視し、その後、創傷を再上皮化する。走査型電子顕微鏡法を用いて、続いて画像処理することにより、上皮細胞形状、および頂端突起を調査して、角膜上皮創傷閉鎖中の様々なステップを研究することができる。

ゼブラフィッシュモデルの特徴は、上皮組織の生理機能および組織が挑戦されたときの上皮細胞の集団的挙動の研究を可能にする。さらに、涙液膜の影響を奪われたモデルの使用は、ストレスに対する角膜応答に関する新しい答えを生み出すことができる。最後に、このモデルはまた、物理的創傷に供される任意の上皮組織に関与する細胞および分子事象の描写を可能にする。この方法は、前臨床試験における薬剤有効性の評価に適用することができる。

上皮のほとんどは外部環境と接触しているため、身体的な損傷を受けやすく、創傷治癒プロセスの研究に適しています。よく研究された組織の中で、角膜は創傷治癒の細胞的および分子的側面の調査において非常に有用なモデルである。透明な外面として、それは目に物理的な保護を提供し、網膜に光を集中させる最初の要素です。網膜の構造と細胞組成は種¹によって異なるが、角膜のこれらの要素は、種に関係なく、すべてのカメラタイプの目で一般的に類似している。

角膜は、3つの主要な層²から構成される。最初で最外層は上皮であり、その透明性を確保するために絶えず更新されています。第2の層は間質であり、厳密に組織化されたコラーゲン線維の厚い層内に、角化細胞と呼ばれる散在細胞を含む。第3および最内層は内皮であり、これは前房から外層への栄養素および液体拡散を可能にする。上皮細胞と間質細胞は、成長因子とサイトカインを介して相互作用^する3。この相互作用は、上皮損傷後の急速なアポトーシスおよびその後の角化細胞の増殖によって強調される^4,5。穿刺などのより深い創傷の場合、角化細胞は治癒過程⁶において積極的な役割を果たす。

すべての実験は、国家動物実験委員会によって承認された。

1. 準備

1. 麻酔²⁶ に用いるトリカイン原液を予め用意しておく(このプロトコールで用いる0.4%原液)。手袋を着用し、可能な限り材料をヒュームフードに入れてください。
   1. 50 mLの0.4%溶液の場合、200 mgのトリカイン粉末を50 mLチューブに秤量する。粉末を約45mLの二重蒸留水?.......

この研究は、ゼブラフィッシュ角膜創傷治癒実験において眼科バリを用いる方法を記載する。この方法は、バリが上皮細胞層を効率的に除去することが示されたマウスに関する以前の研究から改変された¹³。ゼブラフィッシュの角膜創傷における課題には、眼のサイズが比較的小さいこと、および時間のかかる実験の場合、えらを通る一定の水流を維持する必要性が含まれ?.......

角膜の身体的傷害は、眼科患者が病院を訪れる最も一般的な原因である。したがって、角膜病態生理学のさまざまな側面の研究に関連するモデルを確立することが重要です。これまでのところ、マウスは角膜創傷治癒の研究に最も一般的に使用されるモデルである。しかし、角膜創傷治癒に対する特定の薬物の影響を検証するために、マウスの創傷眼に点眼剤を添加することは困難な場合が?.......

著者らは、ゼブラフィッシュユニットへのアクセスについてPertti Panulaに感謝し、ゼブラフィッシュ実験の指導と支援についてHenri Koivulaに感謝している。この研究は、フィンランドアカデミー、ジェーン・アンド・アートス・エルッコ財団、フィンランド文化財団、ATIP-Avenirプログラムの支援を受けました。イメージングは、HiLIFEとBiocenter Finlandの支援を受けて、バイオテクノロジー研究所の電子顕微鏡ユニットと光顕微鏡ユニットで行われました。