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제브라피쉬 각막 상처 치유: 마모에서 상처 폐쇄 영상 분석까지

Published: March 1st, 2022

DOI:

10.3791/63605

1Institute of Biotechnology, HiLIFE, University of Helsinki, 2Institute for Neurosciences of Montpellier, Univ Montpellier

이 프로토콜은 세포 수준에서 후속 상처 폐쇄를 평가하기 위해 마모를 통해 제브라 피쉬의 안구 표면을 손상시키는 데 중점을 둡니다. 이 접근법은 안구 버를 이용하여 각막 상피를 부분적으로 제거하고 주사 전자 현미경을 사용하여 상처 폐쇄 중 세포 형태의 변화를 추적합니다.

눈의 투명한 표면으로서 각막은 맑은 시력을 위해 도움이됩니다. 그것의 위치 때문에,이 조직은 환경 모욕을 받기 쉽습니다. 사실, 임상적으로 가장 자주 발생하는 눈 부상은 각막에 대한 부상입니다. 각막 상처 치유는 작은 포유류 (즉, 생쥐, 쥐 및 토끼)에서 광범위하게 연구되었지만 각막 생리학 연구는 제브라 피쉬가 고전적인 연구 모델임에도 불구하고 제브라 피쉬를 포함한 다른 종을 무시했습니다.

이 보고서는 제브라 피쉬에서 각막 찰과상을 수행하는 방법을 설명합니다. 상처는 안구 버를 사용하여 마취 된 물고기에서 생체 내에서 수행됩니다. 이 방법은 재현 가능한 상피 상처를 허용하여 나머지 눈을 그대로 유지합니다. 찰과상 후, 상처 폐쇄는 3 시간 동안 모니터링되고, 그 후에 상처는 재상피화됩니다. 주사 전자 현미경을 사용하여, 화상 처리, 상피 세포 형상, 및 정점 돌출부를 조사하여 각막 상피 상처 폐쇄 동안 다양한 단계를 연구할 수 있다.

제브라 피쉬 모델의 특성은 조직이 도전받을 때 상피 조직 생리학 및 상피 세포의 집단 행동에 대한 연구를 허용합니다. 또한, 눈물막의 영향을 박탈당한 모델을 사용하면 스트레스에 대한 각막 반응에 관한 새로운 해답을 얻을 수 있습니다. 마지막으로, 이 모델은 또한 물리적 상처를 입은 임의의 상피 조직에 관여하는 세포 및 분자 사건의 묘사를 허용한다. 이 방법은 전임상 시험에서 약물 효과의 평가에 적용될 수 있다.

대부분의 상피는 외부 환경과 접촉하기 때문에 신체적 상해가 발생하기 쉽기 때문에 상처 치유 과정 연구에 매우 적합합니다. 잘 연구 된 조직 중에서 각막은 상처 치유의 세포 및 분자 측면을 조사하는 데 매우 유용한 모델입니다. 투명한 외부 표면으로서, 그것은 눈에 물리적 보호를 제공하고 망막에 빛을 집중시키는 첫 번째 요소입니다. 망막의 구조와 세포 구성은 종1에 따라 다르지만, 각막의 이러한 요소는 종에 관계없이 모든 카메라 형 눈에서 일반적으로 유사합니다.

각막은 세 개의 주요 층2로 구성되어 있습니다. 첫 번째와 가장 바깥 쪽 층은 상피이며, 상피는 투명성을 보장하기 위해 끊임없이 갱신됩니다. 두 번째 층은 엄격하게 조직 된 콜라겐 섬유의 두꺼운 층 내에 각질 세포라고 불리는 흩어져있는 세포를 포함하는 스트로마입니다. 세 번째이자 가장 안쪽에있는 층은 내피이며, 이는 영양소와 액체가 전방 챔버에서 바깥 층으로 확산 될 수있게합니다. 상피 및 기질 세포는 성장 인자 및 사이토카인을 통해 상호작용한다3. 이러한 상호작용은 상피 손상 후 각질세포의 신속한 아폽토시스 및 후속 증식에 의해 강조된다

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모든 실험은 국가 동물 실험위원회에 의해 승인되었다.

1. 준비

  1. 마취26 에 사용되는 트리카인 원액을 미리 준비하십시오 (이 프로토콜에 사용 된 0.4 % 원액). 가능한 한 장갑을 착용하고 재료를 흄 후드에 보관하십시오.
    1. 0.4% 용액 50 mL의 경우, 트리카인 분말 200 mg을 50 mL 튜브에 넣었다. 분말을 약 45 mL의 이중 증류수에 녹인다.
    2. ?.......

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본 연구는 제브라피쉬 각막 상처 치유 실험에서 안과 버를 사용하는 방법을 설명한다. 이 방법은 마우스에 대한 이전의 연구로부터 변형되었으며, 여기서 버는 상피 세포층을 효율적으로 제거하는 것으로 나타났다13. 제브라피쉬 각막 상처의 문제점은 눈의 비교적 작은 크기를 포함하며, 시간이 많이 걸리는 실험의 경우, 아가미를 통한 일정한 물 흐름을 유지할 필요가 있습니다.......

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각막 신체 상해는 안과 환자가 병원을 방문하는 가장 흔한 원인입니다. 따라서 각막 병리 생리학의 다양한 측면에 대한 연구를위한 관련 모델을 수립하는 것이 중요합니다. 지금까지, 마우스는 각막 상처 치유의 연구에 가장 일반적으로 사용되는 모델이다. 그러나 각막 상처 치유에 대한 특정 약물의 영향을 검증하기 위해 뮤린 상처 입은 눈에 점안액을 추가하는 것은 어려울 수 있습니다. 이러한.......

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저자들은 Zebrafish 유닛에 대한 접근에 대해 Pertti Panula와 Henri Koivula에게 제브라 피쉬 실험에 대한 지침과 도움을 주신 것에 감사드립니다. 이 연구는 핀란드 아카데미, Jane and Aatos Erkko Foundation, Finnish Cultural Foundation 및 ATIP-Avenir Program의 지원을 받았습니다. 이미징은 HiLIFE 및 Biocenter Finland가 지원하는 Electron Microscopy 유닛과 생명 공학 연구소의 Light Microscopy Unit에서 수행되었습니다.

....

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NameCompanyCatalog NumberComments
0.1M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4in-houseSolution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4).
0.2M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4in-houseSolution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4).
0.5mm burr tipsAlger Equipment CompanyBU-5S
1M Tris, pH 8.8in-house
adhesive tabsAgar ScientificG3347N
Algerbrush burr, Complete instrumentAlger Equipment CompanyBR2-5
Cotton swapsHeinz Herenz Hamburg1030128
Dissecting platein-house
Dissecting toolsFine Science Tools
double-distilled waterin-house
Eppedorf tubes, 2mlany provider
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate saltSigmaA5040Caution: causes irritation.
Glutaraldehyde, 50% aqueous solution, grade ISigmaG7651Caution: toxic.
Lidocaine hydrochlorideSigmaL5647Caution: toxic.
mountsAgar ScientificG301P
Petri dishThermo Scientific101VR20
pH indicator stripsMacherey-Nagel92110
Plastic spoonsany provider
Plastic tubes, 15 mlGreiner Bio-One188271
Plastic tubes, 50 mlGreiner Bio-One227261
Scanning electron microscopeFEIQuanta 250 FEG
Soft spongeany provider
Sputter coaterQuorum TechnologiesGQ150TS
StereomicroscopeLeica

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