Zebrafish Corneal Wound Healing: Fra slitasje til sårlukking imaging analyse

Denne protokollen fokuserer på å skade den okulære overflaten av sebrafisk gjennom slitasje for å vurdere den påfølgende sårlukkingen på cellenivå. Denne tilnærmingen utnytter en okulær burr for delvis å fjerne hornhinnen epitel og bruker skanning elektronmikroskopi for å spore endringer i cellemorfologi under sårlukking.

Som den gjennomsiktige overflaten av øyet er hornhinnen medvirkende for klart syn. På grunn av sin plassering er dette vevet utsatt for miljømessige fornærmelser. Faktisk er øyeskadene som oftest oppstår klinisk, de til hornhinnen. Mens hornhinnen sår healing har blitt grundig studert i små pattedyr (dvs. mus, rotter og kaniner), hornhinnen fysiologi studier har forsømt andre arter, inkludert sebrafisk, til tross for sebrafisk er en klassisk forskningsmodell.

Denne rapporten beskriver en metode for å utføre en hornhinne slitasje på sebrafisk. Såret utføres in vivo på bedøvet fisk ved hjelp av en okulær burr. Denne metoden gir mulighet for et reproduserbart epitelsår, slik at resten av øyet er intakt. Etter slitasje overvåkes sårlukking i løpet av 3 timer, hvorpå såret reepithelialiseres. Ved å bruke skanning elektronmikroskopi, etterfulgt av bildebehandling, kan epitelcelleformen og apikale fremspring undersøkes for å studere de ulike trinnene under hornhinnen epitelial sårlukking.

Egenskapene til sebrafiskmodellen tillater studie av epitelvevsfysiologien og epitelcellens kollektive oppførsel når vevet utfordres. Videre kan bruken av en modell fratatt påvirkning av tårefilmen gi nye svar angående hornhinnen respons på stress. Til slutt tillater denne modellen også avgrensning av cellulære og molekylære hendelser involvert i ethvert epitelvev utsatt for et fysisk sår. Denne metoden kan brukes til evaluering av legemiddeleffektivitet i preklinisk testing.

Siden det meste av epithelia er i kontakt med det ytre miljø, er de utsatt for fysisk skade, noe som gjør dem godt egnet for studiet av sårhelingsprosesser. Blant de godt studerte vevene er hornhinnen en ekstremt nyttig modell i undersøkelsen av de cellulære og molekylære aspektene ved sårheling. Som en gjennomsiktig ekstern overflate gir den fysisk beskyttelse mot øyet og er det første elementet som fokuserer lyset på netthinnen. Mens strukturen og cellesammensetningen av netthinnen varierer mellom art¹, er disse elementene i hornhinnen generelt like i alle kamera-type øyne, uavhengig av arter.

Hornhinnen består av ....

Alle eksperimenter ble godkjent av det nasjonale dyreeksperimentstavlen.

1. Forberedelser

1. Forbered trikainbestandsløsningen som brukes til anestesi²⁶ på forhånd (0,4% lagerløsning som brukes i denne protokollen). Bruk hansker og oppbevar materialene i en avtrekkshette når det er mulig.
   1. For 50 ml av en 0,4% løsning, vei 200 mg trikainpulver i et 50 ml rør. Løs pulveret i ca. 45 ml dobbeltdestillert vann.
   2. Juster pH i t.......

Denne studien beskriver en metode ved hjelp av en oftalmisk burr i sebrafisk hornhinnen sår healing eksperimenter. Metoden er modifisert fra tidligere studier på mus, hvor burr ble vist å fjerne epitelcellelagene effektivt¹³. Utfordringene i sebrafisk hornhinnen sår inkluderer den relativt små størrelsen på øyet, og i tilfelle av tidkrevende eksperimenter, behovet for å opprettholde en konstant vannstrøm gjennom gjellene (som beskrevet av Xu og kolleger²⁸). De vik.......

Hornhinnen fysiske skader er den vanligste årsaken til oftalmologi pasientbesøk til sykehuset. Derfor er det viktig å etablere relevante modeller for studiet av ulike aspekter av hornhinnen patofysiologi. Så langt er musen den mest brukte modellen for studiet av hornhinnen sårheling. Men å legge øyedråper på murine sårede øyne for å validere virkningen av spesifikke stoffer på hornhinnen sårheling kan være vanskelig. I denne forbindelse er sebrafiskmodellen spesielt nyttig for farmakologisk screening av mo.......

Forfatterne takker Pertti Panula for tilgangen til Sebrafish-enheten og Henri Koivula for veiledning og hjelp med sebrafiskeksperimentene. Denne forskningen ble støttet av Finlands akademi, Jane og Aatos Erkko Foundation, den finske kulturstiftelsen og ATIP-Avenir-programmet. Imaging ble utført ved Electron Microscopy-enheten og Light Microscopy Unit, Institute of Biotechnology, støttet av HiLIFE og Biocenter Finland.