Zebrafish Corneal Wound Healing: Från nötning till sårförslutning Imaging Analysis

Detta protokoll fokuserar på att skada zebrafiskens okulära yta genom nötning för att bedöma den efterföljande sårförslutningen på cellulär nivå. Detta tillvägagångssätt utnyttjar en okulär burr för att delvis avlägsna hornhinnans epitel och använder svepelektronmikroskopi för att spåra förändringar i cellmorfologi under sårförslutning.

Som ögats genomskinliga yta är hornhinnan avgörande för klar syn. På grund av sin plats är denna vävnad benägen för miljöförolämpningar. Faktum är att de ögonskador som oftast uppstår kliniskt är de till hornhinnan. Medan hornhinnans sårläkning har studerats i stor utsträckning hos små däggdjur (dvs. möss, råttor och kaniner), har hornhinnefysiologiska studier försummat andra arter, inklusive zebrafisk, trots att zebrafisk är en klassisk forskningsmodell.

Denna rapport beskriver en metod för att utföra en hornhinnnötning på zebrafisk. Såret utförs in vivo på sövd fisk med användning av en okulär burr. Denna metod möjliggör ett reproducerbart epitelsår och lämnar resten av ögat intakt. Efter nötning övervakas sårförslutning under 3 timmar, varefter såret reepitelialiseras. Genom att använda svepelektronmikroskopi, följt av bildbehandling, kan epitelcellformen och apikala utsprång undersökas för att studera de olika stegen under hornhinnans epitelsårstängning.

Egenskaperna hos zebrafiskmodellen möjliggör studier av epitelvävnadsfysiologin och epitelcellernas kollektiva beteende när vävnaden utmanas. Dessutom kan användningen av en modell som berövas tårfilmens inflytande ge nya svar om hornhinnans svar på stress. Slutligen tillåter denna modell också avgränsningen av de cellulära och molekylära händelserna som är involverade i någon epitelvävnad som utsätts för ett fysiskt sår. Denna metod kan tillämpas på utvärdering av läkemedelseffektivitet vid preklinisk testning.

Eftersom de flesta epitelerna är i kontakt med den yttre miljön är de benägna att skadas fysiskt, vilket gör dem väl lämpade för studier av sårläkningsprocesser. Bland de välstuderade vävnaderna är hornhinnan en extremt användbar modell vid undersökningen av de cellulära och molekylära aspekterna av sårläkning. Som en transparent yttre yta ger den fysiskt skydd för ögat och är det första elementet som fokuserar ljuset på näthinnan. Medan näthinnans struktur och cellsammansättning skiljer sig åt mellan arter¹, är dessa element i hornhinnan i allmänhet lika i alla kameratypsögon, oavsett art.

Hornhinnan består av tre h....

Alla försök godkändes av Djurförsöksnämnden.

1. Förberedelser

1. Förbered trikainsemilösningen som används för anestesi²⁶ i förväg (0,4% stamlösning som används i detta protokoll). Använd handskar och förvara materialen i en dragskåpa när det är möjligt.
   1. För 50 ml av en 0,4% lösning, väg 200 mg trikainpulver i ett 50 ml rör. Lös upp pulvret i cirka 45 ml dubbeldestillerat vatten.
   2. Justera trikainsallös.......

Denna studie beskriver en metod som använder en oftalmisk burr i zebrafisk hornhinnans sårläkningsexperiment. Metoden är modifierad från tidigare studier på möss, där burren visade sig ta bort epitelcellskikten effektivt¹³. Utmaningarna i zebrafisk hornhinnesår inkluderar den relativt lilla storleken på ögat, och i fallet med tidskrävande experiment, behovet av att upprätthålla ett konstant vattenflöde genom gälarna (som beskrivs av Xu och kollegor²⁸). De fr.......

Hornhinneskador är den vanligaste orsaken till oftalmologiska patientbesök på sjukhuset. Därför är det viktigt att fastställa relevanta modeller för studier av olika aspekter av hornhinnans patofysiologi. Hittills är musen den vanligaste modellen för studier av hornhinnans sårläkning. Att lägga till ögondroppar på murina sårade ögon för att validera effekten av specifika läkemedel på hornhinnans sårläkning kan dock vara svårt. I detta avseende är zebrafiskmodellen särskilt användbar för farmako.......

Författarna tackar Pertti Panula för tillgången till zebrafiskenheten och Henri Koivula för vägledningen och hjälpen med zebrafiskexperimenten. Forskningen stöddes av Finlands Akademi, Jane och Aatos Erkkos Stiftelse, Finska kulturfonden och ATIP-Avenir-programmet. Avbildningen utfördes vid elektronmikroskopienheten och ljusmikroskopienheten, Institutet för bioteknik, med stöd av HiLIFE och Biocenter Finland.