JoVE Logo
Faculty Resource Center
Authors
Librarians
High Schools
About

Sign In

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Acknowledgements

Materials

References

Biology

Zebra Balığı Kornea Yara İyileşmesi: Aşınmadan Yara Kapatma Görüntüleme Analizine

Published: March 1st, 2022

DOI:

10.3791/63605

1Institute of Biotechnology, HiLIFE, University of Helsinki, 2Institute for Neurosciences of Montpellier, Univ Montpellier

Bu protokol, hücresel düzeyde sonraki yara kapanmasını değerlendirmek için zebra balıklarının oküler yüzeyine aşınma yoluyla zarar vermeye odaklanır. Bu yaklaşım, kornea epitelini kısmen çıkarmak için bir oküler çapaktan yararlanır ve yara kapanması sırasında hücre morfolojisindeki değişiklikleri izlemek için taramalı elektron mikroskobu kullanır.

Gözün şeffaf yüzeyi olarak, kornea net görme için etkilidir. Konumu nedeniyle, bu doku çevresel hakaretlere eğilimlidir. Nitekim klinik olarak en sık karşılaşılan göz yaralanmaları korneada görülen yaralanmalardır. Kornea yara iyileşmesi küçük memelilerde (yani fareler, sıçanlar ve tavşanlar) kapsamlı bir şekilde incelenirken, kornea fizyolojisi çalışmaları, zebra balığı klasik bir araştırma modeli olmasına rağmen, zebra balığı da dahil olmak üzere diğer türleri ihmal etmiştir.

Bu rapor, zebra balığı üzerinde kornea aşınması gerçekleştirmenin bir yöntemini açıklamaktadır. Yara, oküler çapak kullanılarak anestezi uygulanan balıklarda in vivo olarak gerçekleştirilir. Bu yöntem, gözün geri kalanını sağlam bırakarak tekrarlanabilir bir epitel yarasına izin verir. Aşınmadan sonra, yara kapanması 3 saat boyunca izlenir, daha sonra yara reepitelize edilir. Taramalı elektron mikroskobu kullanılarak, ardından görüntü işleme, epitel hücre şekli ve apikal çıkıntılar, kornea epitel yarası kapanması sırasında çeşitli adımları incelemek için araştırılabilir.

Zebra balığı modelinin özellikleri, epitel dokusu fizyolojisinin ve dokuya meydan okunduğunda epitel hücrelerinin kolektif davranışının incelenmesine izin verir. Ayrıca, gözyaşı filminin etkisinden yoksun bir modelin kullanılması, korneanın strese tepkisi ile ilgili yeni cevaplar üretebilir. Son olarak, bu model aynı zamanda fiziksel bir yaraya maruz kalan herhangi bir epitel dokusunda yer alan hücresel ve moleküler olayların tanımlanmasına da izin verir. Bu yöntem, preklinik testlerde ilaç etkinliğinin değerlendirilmesinde uygulanabilir.

Epitelyaların çoğu dış çevre ile temas halinde olduğundan, fiziksel yaralanmaya eğilimlidirler, bu da onları yara iyileşme süreçlerinin incelenmesi için çok uygun hale getirir. İyi çalışılmış dokular arasında kornea, yara iyileşmesinin hücresel ve moleküler yönlerinin araştırılmasında son derece yararlı bir modeldir. Şeffaf bir dış yüzey olarak göze fiziksel koruma sağlar ve ışığı retinaya odaklayan ilk unsurdur. Retinanın yapısı ve hücre bileşimi tür1 arasında farklılık gösterirken, korneanın bu elementleri, türlerden bağımsız olarak tüm kamera tipi gözlerde genellikle benzerdir.

Kornea üç ana tabakadan oluşur

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tüm deneyler ulusal hayvan deney kurulu tarafından onaylandı.

1. Hazırlıklar

  1. Anestezi26 için kullanılan trikain stok çözeltisini önceden hazırlayın (bu protokolde kullanılan% 0.4 stok çözeltisi). Eldiven kullanın ve malzemeleri mümkün olduğunca bir duman başlığında tutun.
    1. % 0.4'lük bir çözeltinin 50 mL'si için, 50 mL'lik bir tüpe 200 mg trikain tozu tartın. Tozu yaklaşık 45 mL çift damıtılmış suda ç.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu çalışmada, zebra balığı kornea yara iyileşmesi deneylerinde oftalmik çapak kullanan bir yöntem açıklanmaktadır. Yöntem, çapağın epitel hücre katmanlarını verimli bir şekilde çıkardığı gösterilen fareler üzerindeki önceki çalışmalardan modifiye edilmiştir13. Zebra balığı kornea yaralanmasındaki zorluklar, gözün nispeten küçük boyutunu ve zaman alıcı deneyler durumunda, solungaçlardan sabit bir su akışını sürdürme ihtiyacını içerir (Xu ve mesle.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kornea fiziksel yaralanmaları, oftalmoloji hastalarının hastaneye ziyaretlerinin en sık nedenidir. Bu nedenle, kornea patofizyolojisinin farklı yönlerinin incelenmesi için ilgili modellerin oluşturulması önemlidir. Şimdiye kadar, fare kornea yara iyileşmesi çalışması için en yaygın kullanılan modeldir. Bununla birlikte, belirli ilaçların kornea yarasının iyileşmesi üzerindeki etkisini doğrulamak için murin yaralı gözlere göz damlası eklemek zor olabilir. Bu bakımdan, zebra balığı modeli.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Yazarlar, Zebra balığı birimine erişim için Pertti Panula'ya ve zebra balığı deneylerine rehberlik ve yardım için Henri Koivula'ya teşekkür eder. Bu araştırma Finlandiya Akademisi, Jane ve Aatos Erkko Vakfı, Finlandiya Kültür Vakfı ve ATIP-Avenir Programı tarafından desteklenmiştir. Görüntüleme, HiLIFE ve Biocenter Finlandiya tarafından desteklenen Elektron Mikroskobu ünitesinde ve Işık Mikroskobu Ünitesi, Biyoteknoloji Enstitüsü'nde gerçekleştirildi.

....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NameCompanyCatalog NumberComments
0.1M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4in-houseSolution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4).
0.2M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4in-houseSolution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4).
0.5mm burr tipsAlger Equipment CompanyBU-5S
1M Tris, pH 8.8in-house
adhesive tabsAgar ScientificG3347N
Algerbrush burr, Complete instrumentAlger Equipment CompanyBR2-5
Cotton swapsHeinz Herenz Hamburg1030128
Dissecting platein-house
Dissecting toolsFine Science Tools
double-distilled waterin-house
Eppedorf tubes, 2mlany provider
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate saltSigmaA5040Caution: causes irritation.
Glutaraldehyde, 50% aqueous solution, grade ISigmaG7651Caution: toxic.
Lidocaine hydrochlorideSigmaL5647Caution: toxic.
mountsAgar ScientificG301P
Petri dishThermo Scientific101VR20
pH indicator stripsMacherey-Nagel92110
Plastic spoonsany provider
Plastic tubes, 15 mlGreiner Bio-One188271
Plastic tubes, 50 mlGreiner Bio-One227261
Scanning electron microscopeFEIQuanta 250 FEG
Soft spongeany provider
Sputter coaterQuorum TechnologiesGQ150TS
StereomicroscopeLeica

  1. Baden, T., Euler, T., Berens, P. Understanding the retinal basis of vision across species. Nature Reviews.Neuroscience. 21 (1), 5-20 (2020).
  2. Nishida, T., Saika, S., Morishige, N., Manis, M. J., Holland, E. J. Cornea and sclera: Anatomy and physiology. Cornea: Fundamentals, diagnosis and management, 4th ed. , 1-22 (2017).
  3. Wilson, S. E., Liu, J. J., Mohan, R. R. Stromal-epithelial interactions in the cornea. Progress in Retinal and Eye Research. 18 (3), 293-309 (1999).
  4. Wilson, S. E., et al. Epithelial injury induces keratocyte apoptosis: hypothesized role for the interleukin-1 system in the modulation of corneal tissue organization and wound healing. Experimental Eye Research. 62 (4), 325-327 (1996).
  5. Zieske, J. D., Guimaraes, S. R., Hutcheon, A. E. Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement. Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).
  6. West-Mays, J. A., Dwivedi, D. J. The keratocyte: corneal stromal cell with variable repair phenotypes. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 38 (10), 1625-1631 (2006).
  7. Ahmed, F., House, R. J., Feldman, B. H. Corneal abrasions and corneal foreign bodies. Primary Care. 42 (3), 363-375 (2015).
  8. Ben-Eli, H., Erdinest, N., Solomon, A. Pathogenesis and complications of chronic eye rubbing in ocular allergy. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 19 (5), 526-534 (2019).
  9. Wilson, S. A., Last, A. Management of corneal abrasions. American Family Physician. 70 (1), 123-128 (2004).
  10. Nagata, M., et al. JBP485 promotes corneal epithelial wound healing. Scientific Reports. 5, 14776 (2015).
  11. Wang, X., et al. MANF promotes diabetic corneal epithelial wound healing and nerve regeneration by attenuating hyperglycemia-induced endoplasmic reticulum stress. Diabetes. 69 (6), 1264-1278 (2020).
  12. Li, F. J., et al. Evaluation of the AlgerBrush II rotating burr as a tool for inducing ocular surface failure in the New Zealand White rabbit. Experimental Eye Research. 147, 1-11 (2016).
  13. Kalha, S., Kuony, A., Michon, F. Corneal epithelial abrasion with ocular burr as a model for cornea wound healing. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (137), e58071 (2018).
  14. Kalha, S., et al. Bmi1+ progenitor cell dynamics in murine cornea during homeostasis and wound healing. Stem Cells. 36 (4), 562-573 (2018).
  15. Park, M., et al. Visualizing the contribution of keratin-14(+) limbal epithelial precursors in corneal wound healing. Stem Cell Reports. 12 (1), 14-28 (2019).
  16. Kuony, A., et al. Ectodysplasin-A signaling is a key integrator in the lacrimal gland-cornea feedback loop. Development. 146 (14), (2019).
  17. Farrelly, O., et al. Two-photon live imaging of single corneal stem cells reveals compartmentalized organization of the limbal niche. Cell Stem Cell. 28 (7), 1233-1247 (2021).
  18. Ikkala, K., Michon, F., Stratoulias, V. Unilateral Zebrafish corneal injury induces bilateral cell plasticity supporting wound closure. Scientific Reports. , (2021).
  19. Ormerod, L. D., Abelson, M. B., Kenyon, K. R. Standard models of corneal injury using alkali-immersed filter discs. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (10), 2148-2153 (1989).
  20. Anderson, C., Zhou, Q., Wang, S. An alkali-burn injury model of corneal neovascularization in the mouse. Journal of visualized experiments: JoVE. (86), e51159 (2014).
  21. Choi, H., et al. Comprehensive modeling of corneal alkali injury in the rat eye. Current Eye Research. 42 (10), 1348-1357 (2017).
  22. Singh, P., Tyagi, M., Kumar, Y., Gupta, K. K., Sharma, P. D. Ocular chemical injuries and their management. Oman Journal of Ophthalmology. 6 (2), 83-86 (2013).
  23. Pal-Ghosh, S. BALB/c and C57BL6 mouse strains vary in their ability to heal corneal epithelial debridement wounds. Experimental Eye Research. 87 (5), 478-486 (2008).
  24. Chen, J. J., Tseng, S. C. Abnormal corneal epithelial wound healing in partial-thickness removal of limbal epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (8), 2219-2233 (1991).
  25. Xeroudaki, M., Peebo, B., Germundsson, J., Fagerholm, P., Lagali, N. RGTA in corneal wound healing after transepithelial laser ablation in a rabbit model: a randomized, blinded, placebo-controlled study. Acta Ophthalmologica. 94 (7), 685-691 (2016).
  26. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio Available from: https://zfinorg/zf_info/zfbook/zfbk.html (2000)
  27. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  28. Xu, C., Volkery, S., Siekmann, A. F. Intubation-based anesthesia for long-term time-lapse imaging of adult zebrafish. Nature Protocols. 10 (12), 2064-2073 (2015).
  29. Crosson, C. E., Klyce, S. D., Beuerman, R. W. Epithelial wound closure in the rabbit cornea. A biphasic process. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 27 (4), 464-473 (1986).
  30. Parlanti, P., et al. Axonal debris accumulates in corneal epithelial cells after intraepithelial corneal nerves are damaged: A focused Ion Beam Scanning Electron Microscopy (FIB-SEM) study. Experimental Eye Research. 194, 107998 (2020).
  31. Zhao, X. C., et al. The zebrafish cornea: structure and development. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (10), 4341-4348 (2006).
  32. Richardson, R., et al. Re-epithelialization of cutaneous wounds in adult zebrafish combines mechanisms of wound closure in embryonic and adult mammals. Development. 143 (12), 2077-2088 (2016).
  33. van Loon, A. P., Erofeev, I. S., Maryshev, I. V., Goryachev, A. B., Sagasti, A. Cortical contraction drives the 3D patterning of epithelial cell surfaces. The Journal of Cell Biology. 219 (3), (2020).
  34. Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina. Journal of Neurobiology. 44 (3), 289-307 (2000).
  35. Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298 (5601), 2188-2190 (2002).
  36. Becker, T., Wullimann, M. F., Becker, C. G., Bernhardt, R. R., Schachner, M. Axonal regrowth after spinal cord transection in adult zebrafish. The Journal of Comparative Neurology. 377 (4), 577-595 (1997).
  37. Hu, X., et al. Sirt6 deficiency impairs corneal epithelial wound healing. Aging. 10 (8), 1932-1946 (2018).
  38. Ksander, B. R., et al. ABCB5 is a limbal stem cell gene required for corneal development and repair. Nature. 511 (7509), 353-357 (2014).
  39. Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140 (13), 2835-2846 (2013).

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved