इन विट्रो में मस्तिष्क न्यूरोनल सेनेसेंस मॉडलिंग के लिए कॉर्टिकल ब्रेन ऑर्गेनोइड की मजबूत और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पीढ़ी

Published: May 5th, 2022

DOI:

10.3791/63714

Mohammed R. Shaker^1*, Zoe L. Hunter^1*, Ernst J. Wolvetang¹

¹Australian Institute for Bioengineering and Nanotechnology, The University of Queensland

* These authors contributed equally

इस अध्ययन में, हम मानक फीडर मुक्त एचपीएससी संस्कृतियों का उपयोग करके एक सरल लेकिन मजबूत कॉर्टिकल ऑर्गेनोइड संस्कृति प्रणाली के लिए एक विस्तृत तकनीक प्रदान करते हैं। यह ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने के लिए एक तेज़, कुशल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल है जो इन विट्रो में मस्तिष्क सेनेसेंस के पहलुओं को मॉडल करता है।

मस्तिष्क ऑर्गेनोइड विकासशील मानव मस्तिष्क के त्रि-आयामी मॉडल हैं और रोग मॉडलिंग और बड़े पैमाने पर जीनोमिक और ड्रग स्क्रीनिंग के लिए एक सम्मोहक, अत्याधुनिक मंच प्रदान करते हैं। मस्तिष्क ऑर्गेनोइड में कोशिकाओं की आत्म-संगठित प्रकृति और उनकी पीढ़ी के लिए उपलब्ध प्रोटोकॉल की बढ़ती सीमा के कारण, ऑर्गेनोइड के बीच विषमता और परिवर्तनशीलता के मुद्दों की पहचान की गई है। इस प्रोटोकॉल पेपर में, हम एक मजबूत और प्रतिकृति प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो काफी हद तक इन मुद्दों पर काबू पाता है और 1 महीने के भीतर न्यूरोएक्टोडर्मल पूर्वजों से कॉर्टिकल ऑर्गेनोइड उत्पन्न करता है, और जिसे 1 वर्ष से अधिक समय तक बनाए रखा जा सकता है। यह अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल आसानी से एक मानक ऊतक संस्कृति कमरे में किया जा सकता है और आमतौर पर विकासशील मानव प्रांतस्था में पाए जाने वाले सेल प्रकारों की एक समृद्ध विविधता के साथ ऑर्गेनोइड में परिणाम होता है। उनके शुरुआती विकासात्मक मेकअप के बावजूद, न्यूरॉन्स और अन्य मानव मस्तिष्क कोशिका प्रकार इन विट्रो संस्कृति में लंबे समय तक रहने के बाद न्यूरोनल कोशिकाओं में वृद्धावस्था के विशिष्ट संकेतों को प्रदर्शित करना शुरू कर देंगे, जिससे उन्हें उम्र बढ़ने से संबंधित न्यूरोनल प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान और उपयोगी मंच मिल जाएगा। यह प्रोटोकॉल सेनेसेंस से जुड़े बीटा-गैलेक्टोसिडेस धुंधला का उपयोग करके कॉर्टिकल मस्तिष्क ऑर्गेनोइड में ऐसी सेनेसेंट कोशिकाओं का पता लगाने के लिए एक विधि की रूपरेखा भी तैयार करता है।

मानव मस्तिष्क का हमारा वर्तमान ज्ञान काफी हद तक पशु मॉडल और पोस्टमार्टम मस्तिष्क के नमूनों पर आधारित है। स्टेम सेल जीव विज्ञान एक तेजी से आगे बढ़ने वाला क्षेत्र है जो मानव मस्तिष्क के विकास के बुनियादी जीव विज्ञान और मानव मस्तिष्क विकारों के पैथोलॉजिकल ड्राइवरों में नई अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचपीएससी) ऑर्गेनोइड, अंग जैसे त्रि-आयामी (3 डी) ऊतक की पीढ़ी के माध्यम से मानव मस्तिष्क के मॉडलिंग के लिए एक अमूल्य उपकरण है जो आमतौर पर विकासशील मानव मस्तिष्क के विकास प्रक्षेपवक्र, सेलुलर मेकअप और वास्तुकला को दोहराता है। मस्तिष्क ऑर्गेनोइड स्व-इकट्ठे होते हैं और तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं, निर्दिष्ट तंत्रिका पूर्वजों, परिपक्व न्यूरॉन्स और ग्लियाल सेल प्रकारों से बने होते हैं। इसलिए, ऑर्गेनोइड प्रारंभिक मानव मस्तिष्क का अध्ययन करने का एक अनूठा अवसर प्रदान करते हैं, जो अक्सर प्रत्यक्ष प्रयोग के लिए दुर्गम होता है, लेकिन इसकी आंतरिक सीमाएं भी होती हैं जैसे वास्कुलचर की अनुपस्थिति और प्रतिरक्षा प्रणाली।

मस्तिष्क ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने के तरीकों को दो अलग-अलग तरीकों से आगे बढ़ाया गया है: अनियंत्रित और निर्देशित भेदभाव। अनियंत्रित मस्तिष्क ऑर्गेनोइड विधियां स्टेम कोशिकाओं की सहज आंतरिक भेदभाव क्षमताओं पर भरोसा करती हैं जो ऊतक मॉर्फोजेनेसिस ^1,2 को चलाती हैं और अग्रमस्तिष्क, मिडब्रेन और हिंडब्रेन से लेकर विभिन्न प्रकार की सेल वंश पहचान के उद्भव की अनुमति देती हैं, जो कोरॉइड प्लेक्सस, रेटिना और मेसोडर्म तक होती हैं। इसके विपरीत, निर्देशित मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड विधियों को एक मस्तिष्क क्षेत्र प्रकार का प्रतिनिधित्व करने वाले न्यूरोनल वंशावली के वांछित पैटर्निंग की ओर एचपीएससी को चलाने के लिए बाहरी कारकों के पर्याप्त उपयोग की आवश्यकता होती है, जैसे कि औसत दर्जे का गैंग्लियोनिक उत्कृष्टता³, अग्रमस्तिष्क⁴, मिडब्रेन⁵, हाइपोथैलेमस⁶, सेरिबैलम⁷, और कोरॉइड प्लेक्सस⁸। विभिन्न कोशिका वंशों के साथ विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों को उत्पन्न करने की यह क्षमता, और इच्छानुसार इन्हें फ्यूज करने की क्षमता, मस्तिष्क ऑर्गेनोइड को मानव मस्तिष्क के विकास की जांच करने और मस्तिष्क से संबंधित बीमारियों के अंतर्निहित तंत्र को समझने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल बनाती है। यद्यपि मस्तिष्क ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने के लिए ये तरीके मानव मस्तिष्क क्षेत्रों के मॉडलिंग में एक सफलता प्रदान करते हैं, ऑर्गेनोइड के बीच परिवर्तनशीलता और विषमता व्यवस्थित और मात्रात्मक अध्ययन, जैसे कि ड्रग स्क्रीनिंग के लिए एक महत्वपूर्ण सीमा बनी हुई है।

वर्तमान प्रोटोकॉल हमारे हालिया पेपर⁹ में विकसित एक विधि पर आधारित है और इसमें दोहरी एसएमएडी अवरोधकों (एसबी -431542 और एलडीएन 193189) के साथ न्यूरोक्टोडर्म (एनईसीटी) पहचान की ओर एचपीएससी कॉलोनियों का चयनात्मक भेदभाव शामिल है, जो तब एफजीएफ 2 सिग्नलिंग के प्रभाव में 3 डी न्यूरोएपिथेलियम स्फेरॉइड में 4 दिनों के भीतर आत्म-व्यवस्थित करने की क्षमता रखता है। ये न्यूरोएपिथेलियम स्फेरॉइड मज़बूती से भेदभाव के 4 सप्ताह के भीतर विवो जैसी सेलुलर संरचना के साथ समरूप कॉर्टिकल ऑर्गेनोइड उत्पन्न करते हैं। यहां वर्णित प्रोटोकॉल हमारे पिछले निष्कर्षों पर बनाया गया है जो दिखाता है कि दोहरी एसएमएडी (डिकैपेंटाप्लेजिक के खिलाफ माताओं का दमन) सिग्नलिंग का निषेध न्यूरोक्टोडर्मल पूर्वजों से प्राप्त रोस्ट्रल तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं की ओर एचपीएससी के भेदभाव को बढ़ावा देता है^। . इसके अलावा, एचईएससी-योग्य तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में न्यूरोएपिथेलियम स्फेरॉइड का एम्बेडिंग न्यूरोएपिथेलिया के महत्वपूर्ण नवोदित को ट्रिगर करता है, जो एपिकोबासल ध्रुवीयता के साथ वेंट्रिकल्स बनाता है। बड़े पैमाने पर संस्कृति ने सेल लाइनों, क्लोन या बैचों से स्वतंत्र कॉर्टिकल ऑर्गेनोइड की प्रजनन क्षमता और एकरूपता दिखाई, और इस प्रकार इन विट्रो में स्वास्थ्य और रोग में प्रारंभिक मानव कॉर्टिकल विकास की नकल करने के लिए एक विश्वसनीय और स्थिर स्टेम सेल प्रणाली का प्रतिनिधित्व करता है। हम आगे एचपीएससी-व्युत्पन्न कॉर्टिकल मस्तिष्क ऑर्गेनोइड में सेनेसेंट न्यूरोनल सेल मार्करों का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल की रूपरेखा तैयार करते हैं जो लंबे समय तक सुसंस्कृत हैं।

20% -30% के बोने के घनत्व पर एचपीएससी चढ़ाना के बाद, कोशिकाओं को न्यूरोक्टोडर्मल कॉलोनियों की ओर एचपीएससी कॉलोनियों को अलग करने के लिए 3 दिनों के लिए दोहरी एसएमएडी अवरोधकों के साथ इलाज किया जाता है। इन कॉलोनियों को तब धीरे-धीरे विघटन के साथ उठाया जाता है और एफजीएफ 2 के साथ पूरक अल्ट्रा-लो अटैचमेंट 6-अच्छी तरह से प्लेटों में वरीयता दी जाती है। फ्लोटिंग 2 डी कॉलोनियां रात भर 3 डी न्यूरोक्टोडर्मल स्फेरॉइड में स्वयं को व्यवस्थित करती हैं और एफजीएफ 2 के साथ दैनिक पूरक एन 2 माध्यम में 4 दिनों तक बनाए रखी जाती हैं। एक बार स्फेरॉइड न्यूरोएपिथेलियल परत स्थापित कर लेते हैं, तो उन्हें तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में एम्बेड किया जा सकता है। नियमित रूप से ताजा टर्मिनल भेदभाव माध्यम जोड़कर, शोधकर्ता कॉर्टिकल ऑर्गेनोइड में न्यूरोएपिथेलिया के प्रगतिशील विस्तार और नवोदित का निरीक्षण करेंगे। शोधकर्ता ट्रांसक्रिप्शनल और प्रोटिओमिक प्रोफाइलिंग का संचालन करने के लिए इन ऑर्गेनोइड को अलग करना चाह सकते हैं। इसके अतिरिक्त, कॉर्टिकल ऑर्गेनोइड की गुणवत्ता की निगरानी के लिए ब्राइटफील्ड इमेजिंग की सिफारिश की जाती है। विश्लेषण निर्धारण, क्रायोसेक्शन और इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा किया जा सकता है। इन तकनीकों के लिए विवरण और विधियों को पहले^{वर्णित} किया गया है 12. आखिरकार, यह प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को कम लागत और सीमित उपकरणों के साथ विकासशील मानव कॉर्टिकल मस्तिष्क के मॉडलिंग के लिए सजातीय कॉर्टिकल मस्तिष्क ऑर्गेनोइड को तेजी से और मजबूती से उत्पन्न करने की अनुमति देता है, और सेलुलर न्यूरोनल सेनेसेंस के पहलुओं का अध्ययन करने के लिए, जैसा कि इस पत्र में उल्लिखित है।

1. कॉर्टिकल मस्तिष्क ऑर्गेनोइड पीढ़ी

नोट: प्रोटोकॉल के इस खंड में सभी चरण कक्षा 2 जैव सुरक्षा हुड में होंगे, जब तक कि अन्यथा नहीं कहा गया हो।

एचपीएससी 2 डी संस्कृति से 2 डी न्यूरोएक्टोडर्मल कॉलोनियों का प्रेरण (दिन -1 से 3)
1. प्रेरण से पहले, 20% -30% घनत्व पर 6-अच्छी तरह से प्लेट में एचईएससी योग्य तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स पर एचपीएससी कॉलोनियों को प्लेट करें। 6-अच्छी तरह से प्लेट के तीन कुओं में 60% संगम पर 6-अच्छी तरह से प्लेट के एक कुएं से एचपीएससी कॉलोनियों को पारित करके इस घनत्व को प्राप्त करें।
2. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स कोटिंग के लिए, एक सादे बेसल माध्यम में 1:50 के अनुपात में तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स को पतला करें। समान रूप से 6-अच्छी तरह से प्लेट के 1 एमएल / अच्छी तरह से जमा करें, कमरे के तापमान (आरटी) पर 1 घंटे के लिए सेते हैं, और फिर एस्पिरेट करते हैं।
3. भेदभाव से पहले सीरम मुक्त सेल संस्कृति माध्यम के 2 एमएल में 1 दिन के लिए एचपीएससी कॉलोनियों को बनाए रखें।
4. एचपीएससी भेदभाव के दिन, बिना किसी पता लगाने योग्य भेदभाव के स्वस्थ कॉलोनियों को सुनिश्चित करने के लिए 4x से 10x आवर्धन पर ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके एचपीएससी कॉलोनियों का निरीक्षण करें।
  नोट: स्वस्थ एचपीएससी कोशिकाओं के साथ तंग किनारे कालोनियों का निर्माण करेंगे जिनमें एक बड़ा नाभिक, बहुत छोटा साइटोप्लाज्म और प्रमुख न्यूक्लियोली होता है। विभेदित आईपीएससी कॉलोनियां ऊपर वर्णित एचपीएससी कॉलोनियों के लिए स्पष्ट रूपात्मक अंतर प्रदर्शित करेंगी, विशेष रूप से कॉलोनियों के बाहरी किनारों के आसपास या केंद्र में।
5. भेदभाव के लिए आवश्यक एन 2 माध्यम बनाने के लिए तालिका 1 में सूचीबद्ध अभिकर्मकों को जोड़ें। उपयोग करने से पहले इस माध्यम को आरटी में लाएं।
6. आरटी पर एक बार, 6-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं से सीरम मुक्त सेल संस्कृति माध्यम की आकांक्षा करें और धीरे-धीरे 5 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ जोड़े गए एन 2 माध्यम के 2 एमएल के साथ प्रतिस्थापित करें।
7. दोहरी एसएमएडी अवरोधकों, एसबी -431542 (10 μM) और एलडीएन 193189 (100 एनएम) जोड़ें।
  नोट: एसएमएडी अवरोधकों को एन 2 माध्यम में जोड़ा जा सकता है जब माध्यम को प्रत्येक कुएं में रखा गया है, या सीरम मुक्त सेल संस्कृति माध्यम को बदलने से पहले एन 2 माध्यम की आवश्यक मात्रा में। अवरोधकों को प्लेट को धीरे-धीरे घुमाकर या माध्यम और अवरोधकों वाले ट्यूब को 3-4 बार उलटकर माध्यम में समान रूप से शामिल किया जा सकता है।
8. अगले 2 दिनों के लिए प्रत्येक कुएं में दैनिक एसबी -431542 (10 μM) और एलडीएन 193189 (100 एनएम) के साथ पूरक ताजा एन 2 मीडिया जोड़ें।
  नोट: ताजा एन 2 माध्यम डीएमएसओ के लिए कोशिकाओं के लंबे समय तक संपर्क को कम करने के लिए जोड़ा जाता है जिसका उपयोग एसबी -431542 और एलडीएन 193189 यौगिकों को भंग करने और साइटोटॉक्सिसिटी को रोकने के लिए किया जाता है।
प्रेरित 2 डी न्यूरोएक्टोडर्मल कॉलोनियों से 3 डी न्यूरोएक्टोडर्मल स्फेरॉइड की पीढ़ी (दिन 3 से 7)
1. 1.2.2-1.2.8 चरणों के बाद डिस्पेस का उपयोग करके प्रेरित न्यूरोक्टोडर्मल कॉलोनियों को उठाएं।
2. सबसे पहले, 6-अच्छी तरह से प्लेट से एन 2 माध्यम के 2 एमएल को हटा दें, और यह सुनिश्चित करने के लिए एचबीएसएस के साथ 1 एक्स धो लें कि सभी एन 2 माध्यम हटा दिए गए हैं।
  नोट: एन 2 माध्यम विघटन की एंजाइम गतिविधि में हस्तक्षेप कर सकता है, कुएं से न्यूरोक्टोडर्मल कॉलोनियों की पर्याप्त टुकड़ी को रोक सकता है।
3. प्रत्येक कॉलोनी युक्त कुएं में 2.4 यूनिट / एमएल डिस्पेस का 1 एमएल जोड़ें।
4. 37 डिग्री सेल्सियस पर 20-25 मिनट (अधिकतम 30 मिनट) के लिए अच्छी तरह से सेते हैं। नियमित रूप से कॉलोनी टुकड़ी की जांच करें।
  नोट: छोटी कॉलोनियां 20 मिनट के भीतर अलग हो सकती हैं। 30 मिनट के बाद फंसी रहने वाली किसी भी कॉलोनी को नजरअंदाज कर दिया जाना चाहिए।
5. इनक्यूबेशन के बाद, विघटन एंजाइम की गतिविधि को रोकने के लिए कुएं में एन 2 माध्यम के 1 एमएल जोड़ें और एक विस्तृत बोर पी 1000 पिपेट टिप या बाँझ कैंची के साथ एक संशोधित पी 1000 पिपेट टिप का उपयोग करके कॉलोनियों को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें (इसे एक विस्तृत बोर पी 1000 टिप बनाते हुए)।
6. कॉलोनी के गुच्छों को गुरुत्वाकर्षण के साथ ट्यूब के नीचे डूबने की अनुमति दें।
  नोट: इस प्रक्रिया में लगभग 1 मिनट लगेंगे।
7. एक बार गुच्छे डूब जाने के बाद, ध्यान से एक मानक पी 1000 पिपेट टिप के साथ सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और इसे ताजा एन 2 माध्यम के 1 एमएल के साथ प्रतिस्थापित करें। डिस्पेज़ को पूरी तरह से हटाने के लिए इस धोने के चरण को तीन बार दोहराएं।
  नोट: कोई भी शेष विघटन न्यूरोएक्टोडर्मल स्फेरॉइड के एक समान गठन को रोक देगा और कोशिका मृत्यु को प्रेरित करेगा।
8. धोने के बाद, एन 2 माध्यम के 3 एमएल में सेल क्लंप को फिर से निलंबित करें और 6-अच्छी तरह से प्लेट के एक कुएं में स्थानांतरित करें और बीएफजीएफ के 40 एनजी /
  नोट: यदि उच्च संख्या में न्यूरोक्टोडर्मल कॉलोनियों को अलग किया गया था, तो इन कॉलोनियों को स्फेरॉइड संलयन को रोकने के लिए 6-अच्छी तरह से प्लेट के दो या दो से अधिक कुओं में चढ़ाया जा सकता है। कालोनियों की विघटन टुकड़ी के 24 घंटे बाद, जांचें कि क्या स्फेरॉइड का गठन हुआ है।
9. अगले 3-4 दिनों के लिए एक ही मीडिया में स्फेरॉइड बनाए रखें, लेकिन न्यूरोएक्टोडर्मल सेल प्रसार, आत्म-आयोजन को बढ़ावा देने और न्यूरोएपिथेलिया को प्रेरित करने और विस्तारित करने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से दैनिक में ताजा बीएफजीएफ (40 एनजी /
  नोट: यदि स्फेरॉइड को उच्च घनत्व पर चढ़ाया गया है, तो मीडिया पीले रंग में बदलने की संभावना है और हर 2 दिनों में ताजा बीएफजीएफ (40 एनजी / हालांकि, इसकी सिफारिश नहीं की जाती है, और इसके बजाय, इस मुद्दे से बचने के लिए प्रत्येक कुएं में कम संख्या में स्फेरॉइड बनाए रखा जाना चाहिए। यदि न्यूरोएपिथेलिया स्पष्ट हैं तो 3 दिनों के बाद तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में स्फेरॉइड को एम्बेड किया जा सकता है। यदि न्यूरोएपिथेलिया स्पष्ट नहीं है या मजबूत नहीं दिखता है, तो स्फेरॉइड को एक और दिन के लिए बनाए रखें और फिर से जांचें।
कॉर्टिकल मस्तिष्क ऑर्गेनोइड भेदभाव और रखरखाव (दिन 8)
1. तालिका 2 में सूचीबद्ध अभिकर्मकों का उपयोग करके टर्मिनल भेदभाव मीडिया (डीएम) तैयार करें। इस मीडिया को आरटी में लाएं।
2. बर्फ पर 100% एचईएससी-योग्य तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स पिघलना।
3. 10 सेमी पेट्री डिश में 70% इथेनॉल के साथ निष्फल डिंपल के साथ पैराफिल्म की एक शीट तैयार करें और इसे हुड के नीचे स्टीरियोमाइक्रोस्कोप पर रखें।
  नोट: 200 μL विंदुक युक्तियों की एक खाली ट्रे डिंपल का एक ग्रिड उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
4. एक 100 μL विंदुक टिप (यह व्यापक बोर बनाने के लिए) से अंत में कटौती। इसका उपयोग तहखाने मैट्रिक्स में तंत्रिका स्फेरॉइड को तोड़ने के बिना एम्बेड करने के लिए किया जाएगा।
5. स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग करके, 6-अच्छी तरह से प्लेट से समान आकार के तंत्रिका स्फेरॉइड (500 μm) का चयन करें और उन्हें चौड़े-बोर 100 μL पिपेट टिप का उपयोग करके पैराफिल्म-डिंपल में स्थानांतरित करें, प्रति डिंपल एक एकल तंत्रिका गोलाकार रखें।
6. धीरे-धीरे किसी भी अतिरिक्त मीडिया को हटा दें, जिससे स्फेरॉइड को कवर करने के लिए पर्याप्त छोड़ दिया जाए।
  नोट: यह तहखाने मैट्रिक्स को जोड़ने से पहले स्फेरॉइड की गुणवत्ता को बनाए रखने और यह सुनिश्चित करने के लिए है कि वे सूख न जाएं।
7. धीरे-धीरे स्फेरॉइड पर तहखाने मैट्रिक्स के 18 μL जोड़ें, मैट्रिक्स ड्रॉप के केंद्र के भीतर गोलाकार स्थिति। मैट्रिक्स में स्फेरॉइड को केंद्रित करने के लिए एक 10 μL पिपेट टिप के अंत का उपयोग करें।
  नोट: सूखने से स्फेरॉइड के आसपास अतिरिक्त मीडिया से बचने के लिए जितनी जल्दी हो सके तहखाने मैट्रिक्स जोड़ने का प्रयास करें।
8. 10 सेमी पेट्री डिश को कवर करें और इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें और 25 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर तहखाने मैट्रिक्स एम्बेडेड स्फेरॉइड के साथ पैराफिल्म डिश सेते हैं।
9. इनक्यूबेशन के बाद, डीएम मीडिया के 0.5 एमएल के साथ पी 1000 टिप का उपयोग करके एम्बेडेड स्फेरॉइड को कम लगाव 24-अच्छी तरह से प्लेट में कुल्लाएं, यह सुनिश्चित करें कि व्यक्तिगत एम्बेडेड स्फेरॉइड प्रत्येक में एक अच्छी तरह से रखे गए हैं।
  नोट: यदि एक से अधिक एम्बेडेड स्फेरॉइड एक कुएं में गिरता है, तो दूसरे स्फेरॉइड को एक नए कुएं में स्थानांतरित करने के लिए एक विस्तृत बोर पी 1000 टिप का उपयोग करें।
10. लंबे समय तक डीएम मीडिया में विभेदित कॉर्टिकल मस्तिष्क ऑर्गेनोइड को बनाए रखें, हर 2 दिनों में होने वाले मीडिया परिवर्तनों के साथ जब ऑर्गेनोइड बड़े और पुराने हो जाते हैं।
  नोट: भेदभाव के पहले सप्ताह के दौरान, माध्यम को हर 3 दिनों में बदला जा सकता है।

2. कॉर्टिकल ऑर्गेनोइड में न्यूरोनल उम्र बढ़ने की विशेषता

क्रायोसेक्शन के लिए प्रक्रिया कॉर्टिकल ऑर्गेनोइड:
नोट: चरण एक कक्षा 2 जैव सुरक्षा हुड में किए गए थे।
1. 2 एमएल ट्यूब तैयार करें, प्रत्येक 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के 1.5 एमएल से भरा हुआ है।
2. एक पी 1000 पिपेट टिप के अंत में कटौती करें (इसे एक विस्तृत बोर बनाने के लिए) और धीरे-धीरे प्रत्येक ऑर्गेनोइड को ऊपर तैयार 2 एमएल ट्यूबों में से एक में स्थानांतरित करें (प्रति ट्यूब एक ऑर्गेनोइड)।
  नोट: पीएफए के साथ अतिरिक्त डीएम मीडिया मिश्रण को रोकने के लिए, ऑर्गेनोइड को पी 1000 पिपेट टिप के उद्घाटन की ओर डूबने की अनुमति दें और ऑर्गेनॉइड को बाहर निकालने से पहले ट्यूब में पीएफए के शीर्ष के ठीक ऊपर टिप को आराम दें। यह शोधकर्ता को केवल ऑर्गेनोइड और बहुत कम मीडिया को स्थानांतरित करने में सक्षम करेगा।
3. निर्धारण प्रक्रिया को 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर होने दें।
4. एक बिना खतना के पी 1000 पिपेट टिप का उपयोग करना, ध्यान से अतिरिक्त पीएफए की आकांक्षा करें और ठंड 1 एक्स पीबीएस के 1.5 एमएल जोड़ें।
5. आरटी पर 10 मिनट के लिए 70 आरपीएम पर सेट एक कक्षीय प्रकार के बरतन करने के लिए ट्यूबों स्थानांतरण।
6. सभी पीएफए को अच्छी तरह से हटा दिया गया है यह सुनिश्चित करने के लिए ठंड 1x पीबीएस के साथ धोने की प्रक्रिया को तीन बार दोहराएं।
  नोट: नियमित अपशिष्ट कंटेनरों में पीएफए का निपटान न करें; इसके बजाय, इसके लिए एक विशिष्ट रासायनिक अपशिष्ट निपटान कंटेनर तैयार करें, क्योंकि पीएफए एक खतरा है।
7. 30% सुक्रोज युक्त 1x पीबीएस में ऑर्गेनोइड को विसर्जित करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं जब तक कि सभी ऑर्गेनोइड ट्यूब के नीचे डूब न जाएं।
  नोट: ऑर्गेनोइड को डूबने की अनुमति देने के लिए आवश्यक समय ऑर्गेनोइड के आकार / 3 महीने के ऑर्गेनोइड में 5 घंटे तक का समय लग सकता है।
8. एक कट, चौड़े बोर पी 1000 पिपेट टिप का उपयोग करके, धीरे-धीरे 30% सुक्रोज और 100% इष्टतम काटने के तापमान (ओसीटी) माध्यम से बने बढ़ते समाधान वाले बढ़ते मोल्ड में तीन से पांच ऑर्गेनोइड को स्थानांतरित करें, 3: 2 के अनुपात में।
9. ग्रिड जैसे पैटर्न में ऑर्गेनोइड को उन्मुख और स्थिति देने के लिए एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप की सहायता से 10 μL पिपेट टिप का उपयोग करें।
10. क्रायोस्टैट का उपयोग करके क्रायो-सेक्शनिंग (16-20 μm) के साथ आगे बढ़ने से पहले सुक्रोज ओसीटी समाधान को ठोस बनाने के लिए सूखी बर्फ पर मोल्ड रखें।
  नोट: सेनेसेंस से जुड़े बीटा-गैलेक्टोसिडेस के लिए, सभी ऊतकों को डूबने के बाद सेक्शनिंग के लिए संसाधित किया जाना चाहिए। इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए, ऊतकों को अगले दिन सेक्शनिंग के लिए संसाधित किया जा सकता है। अनुभागों वाले सभी स्लाइडों को बाद में इम्यूनोफ्लोरेसेंस या बीटा-गैलेक्टोसिडेस से पहले -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए, अगर तुरंत दाग नहीं दिया जाता है।
कॉर्टिकल मस्तिष्क ऑर्गेनोइड में वृद्धावस्था के विश्लेषण के लिए प्रक्रिया:
नोट: निम्नलिखित चरणों को एक नियमित प्रयोगशाला बेंच पर किया जा सकता है।
1. एक ढक्कन के साथ एक माइक्रोस्कोप स्लाइड धुंधला कंटेनर में स्लाइड स्थानांतरण और किसी भी अतिरिक्त बढ़ते समाधान को हटाने के लिए आरटी पर 10 मिनट के लिए 1x पीबीएस के साथ तीन बार खंडित ऑर्गेनोइड ऊतक धो लें।
2. इसके बाद, 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर ताजा बने बीटा-गैलेक्टोसिडेज धुंधला समाधान के साथ धोए गए ऊतक सेते हैं।
  नोट: बीटा-गैलेक्टोसिडेस धुंधला समाधान फॉस्फेट बफर (फॉस्फेट बफर के 10 एमएल के लिए: 1 एम एनएएच₂पीओ₄ के 8.15 एमएल, 1 एम ना₂एचपीओ₄ के 1.85 एमएल) समायोजित पीएच = 6, पोटेशियम हेक्सासाइनोफेरेट (III) के 100 एमएम, पोटेशियम हेक्सासायनोफेरेट के 100 एमएम से बना है एक्स-गैल के 20 मिलीग्राम / सीओ₂ युक्त एक मानक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर का उपयोग करने से बचें क्योंकि सीओ₂ बीटा-गैलेक्टोसिडेस धुंधला समाधान के पीएच को बदल देगा।
3. बीटा-गैलेक्टोसिडेस समाधान को हटाने के लिए आरटी में प्रत्येक 10 मिनट के लिए 1 एक्स पीबीएस के साथ दाग वाले ऊतकों को तीन बार धो लें।
4. एक गिलास एंटीफेड माउंटेंट के साथ धोया ऊतकों माउंट और माइक्रोस्कोप के तहत देखने से पहले आरटी पर 30 मिनट के लिए ठोस करने के लिए बढ़ते समाधान की अनुमति देते हैं।

यहां हमने एक मजबूत प्रोटोकॉल का वर्णन किया है जो शोधकर्ताओं को समरूप एचपीएससी-व्युत्पन्न कॉर्टिकल मस्तिष्क ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने की अनुमति देता है जो संस्कृति के 1-3 महीनों के भीतर विवो मानव कॉर्टिकल मस्तिष्क क्षेत्र की नकल करते हैं। एचपीएससी कॉलोनियों को पहले न्यूरोएक्टोडर्मल कॉलोनियों को उत्पन्न करने के लिए भेदभाव मीडिया में सुसंस्कृत किया जाता है, जिसका उपयोग तंत्रिका स्फेरॉइड बनाने के लिए किया जा सकता है। इन स्फेरॉइड को बाद में एक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में एम्बेडेड किया जाता है और ऑर्गेनोइड का उत्पादन करने के लिए लंबे समय तक बनाए रखा जाता है जिसका उपयोग न्यूरोनल उम्र बढ़ने के मॉडल के लिए किया जा सकता है (प्रोटोकॉल की रूपरेखा के लिए चित्रा 1 देखें)। यह ध्यान देने योग्य है कि अल्ट्रा-अनकोटेड 24-वेल प्लेटों में इन ऑर्गेनोइड्स को संवर्धन सेलुलर तनाव का कारण बनता है और इन विट्रो संस्कृति के 13 सप्ताह में सेनेसेंस से जुड़े फेनोटाइप को बढ़ावा देता है। इस प्रोटोकॉल से व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड को इष्टतम विकास और कॉर्टिकल प्लेट तंत्रिका कोशिकाओं के भेदभाव या वायु-तरल इंटरफ़ेस पर उत्तेजित बायोरिएक्टरों में भी बनाए रखा जा सकता है।

शुरू करने के लिए, एचपीएससी कॉलोनियों को न्यूरोक्टोडर्मल भेदभाव से पहले 1 दिन के लिए सुसंस्कृत किया जाता है। यह महत्वपूर्ण है कि इन एचपीएससी कॉलोनियों को केवल 20% -30% संगम के लिए सुसंस्कृत किया जाता है और उच्चतम संभव गुणवत्ता के होते हैं: कॉलोनियों (चित्रा 2 ए, बी) को दूषित करने वाली कोई विभेदित कोशिकाओं के साथ एक तंग फ्लैट मोनोलेयर। एचपीएससी कॉलोनियों की प्लुरिपोटेंसी की पुष्टि एनएएनओजी (चित्रा 2 सी) जैसे मार्करों की अभिव्यक्ति से की जानी चाहिए। मान्य एचपीएससी कॉलोनियों को तब एसबी -431542 और एलडीएन 193189 के साथ एन 2 न्यूरोएक्टोडर्मल भेदभाव मीडिया के संपर्क में लाया जाता है। इस मीडिया में रखरखाव के 3 दिनों के बाद, एचपीएससी कॉलोनियों को न्यूरोएक्टोडर्मल कॉलोनियों में विभेदित किया जाना चाहिए और अब एचपीएससी (चित्रा 2 बी) के एक ही तंग फ्लैट मोनोलेयर आकृति विज्ञान को नहीं दिखाना चाहिए, बल्कि, वे लंबे समय तक स्तंभ के आकार की कोशिकाएं (चित्रा 2 बी) बन जाएंगे। ये कोशिकाएं नैनोग (चित्रा 2 सी) जैसे प्लुरिपोटेंसी मार्करों के लिए भी नकारात्मक होंगी।

यह इस स्तर पर है कि न्यूरोएक्टोडर्मल कॉलोनियों को एंजाइमेटिक रूप से विघटन के साथ अलग किया जाता है, और प्रत्येक स्वस्थ और सफलतापूर्वक अलग कॉलोनी को आत्म-व्यवस्थित करने और एक युवा तंत्रिका गोलाकार (चित्रा 2 डी, पूरक वीडियो 1) बनाने की अनुमति दी जाती है। केवल स्वस्थ, स्वच्छ न्यूरोएक्टोडर्मल कॉलोनियां विघटन गतिविधि के लिए निर्दिष्ट समय सीमा में अलग हो जाएंगी; अन्य सभी कॉलोनियों को नजरअंदाज किया जाना चाहिए क्योंकि उनके परिणामस्वरूप गोलाकार की खराब गुणवत्ता होगी। एन 2 मीडिया में एफजीएफ 2 के दैनिक संपर्क के साथ, इन स्फेरॉइड (चित्रा 2 डी, दिन 1) में तंत्रिका स्टेम सेल (एसओएक्स 2 +) का प्रसार होगा और तंत्रिका रोसेट (चित्रा 2 डी, दिन 4) की एक महत्वपूर्ण संख्या का निर्माण होगा। ये रोसेट रोसेट के केंद्र के भीतर और गोलाकार के बाहरी किनारे के साथ स्थित कोशिकाओं में तंग जंक्शन और उपकला मार्कर ज़ो 1 को व्यक्त करेंगे, जो स्फेरॉइड (चित्रा 2 डी, दिन 4) की एपिकल-बेसल ध्रुवीयता का प्रदर्शन करते हैं। स्फेरॉइड के होलमाउंट 3 डी इमेजिंग की विधि¹³ से पहले वर्णित की गई है। स्फेरॉइड के दैनिक निरीक्षण को एक तंग, अंधेरे बाहरी किनारे और स्फेरॉइड की उज्ज्वल परिधि के गठन को स्पष्ट करना चाहिए, यह न्यूरोएपिथेलियल परत है। इस परत को 500 μm के अनुमानित व्यास के साथ 3-4 दिनों के बाद पर्याप्त रूप से बनाया जाना चाहिए, जिस समय तहखाने मैट्रिक्स में स्फेरॉइड एम्बेड किए जा सकते हैं। यदि यह परत मौजूद नहीं है या केवल कमजोर रूप से बनाई गई है, तो स्फेरॉइड को आगे बढ़ाने के लिए पर्याप्त रूप से विकसित नहीं किया जाता है। किसी भी बदलाव का निरीक्षण करने के लिए एक और दिन प्रतीक्षा करने की सिफारिश की जाती है, लेकिन यदि यह नहीं देखा जाता है, तो इन स्फेरॉइड की उपेक्षा करें।

संस्कृति के 3 दिनों के बाद स्फेरॉइड की एक प्रतिनिधि ब्राइटफील्ड छवि चित्रा 2 डी में देखी जा सकती है। एक तंग न्यूरोएपिथेलियल परत वाले स्फेरॉइड जो अन्य पड़ोसी स्फेरॉइड के साथ जुड़े नहीं हैं, अर्ध-पारदर्शी ऊतक हैं, और तंत्रिका रोसेट गठन का प्रदर्शन करते हैं, तहखाने मैट्रिक्स में एम्बेडेड होने के लिए चुने जाते हैं। एक बार एम्बेडेड होने के बाद, गोलाकार तेजी से फैल जाएगा और नवोदित होना शुरू हो जाएगा: कॉम्पैक्ट ऊतक के नोड्स दिखाई देंगे, जो गोलाकार के मुख्य शरीर से बाहर की ओर विस्तार करेंगे। यह तहखाने मैट्रिक्स में 1-3 सप्ताह के बीच स्पष्ट है और कई सेल लाइनों (चित्रा 3 ए) में मनाया जा सकता है। एम्बेडेड स्फेरॉइड का मात्रात्मक विश्लेषण तीन अलग-अलग सेल लाइनों में स्फेरॉइड के 100% तक उपकला कोशिकाओं की उपस्थिति की पुष्टि करता है, इस प्रोटोकॉल (चित्रा 3 बी) से अपेक्षित समरूपता और प्रजनन क्षमता की पुष्टि करता है। इन विट्रो भेदभाव के दौरान ऑर्गेनोइड व्यास की मात्रा का ठहराव एचपीएससी (चित्रा 3 सी) की विभिन्न लाइनों में प्रजनन क्षमता की पुष्टि करता है। यदि नवोदित नहीं होता है, तो स्फेरॉइड उचित रूप से विकसित नहीं हो रहे हैं और उन्हें त्याग दिया जाना चाहिए। एक बार जब स्फेरॉइड मैट्रिक्स में एम्बेडेड हो जाते हैं, तो उनका विकास आगे बढ़ता है, और स्फेरॉइड को अब ऑर्गेनोइड के रूप में जाना जाता है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला भी तंत्रिका पूर्वज कोशिकाओं (पीएएक्स 6) के साथ-साथ स्पष्ट लेयरिंग (चित्रा 3 डी, ई) के साथ ऑर्गेनोइड में सीटीआईपी 2 और एसएटीबी 2 के साथ दाग वाले कॉर्टिकल लेयर मार्करों की उपस्थिति की पुष्टि करता है। यह लेयरिंग ऑर्गेनोइड रखरखाव (चित्रा 3 डी, ई) के विभिन्न समय बिंदुओं में अवलोकन योग्य है। ऊतकों की इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री की विधि¹⁴ से पहले वर्णित की गई है।

इन ऑर्गेनोइड्स का एक संभावित अनुप्रयोग यह अध्ययन करना है कि न्यूरोनल उम्र बढ़ने से संबंधित प्रक्रियाएं मस्तिष्क को कैसे प्रभावित करती हैं। इसकी जांच करने के लिए, सफलतापूर्वक उत्पन्न ऑर्गेनोइड को सेनेसेंस के मानक आणविक बायोमार्कर जैसे सेनेसेंस से जुड़े बीटा-गैलेक्टोसिडेस और पी 21 के लिए सेक्शनिंग और धुंधला करने के लिए कई अलग-अलग समय बिंदुओं से काटा जाता है। चित्रा 4 ए तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में एम्बेड करने के 4 और 13 सप्ताह बाद ऑर्गेनोइड के सेनेसेंस से जुड़े बीटा-गैलेक्टोसिडेस धुंधला होने की एक प्रतिनिधि छवि दिखाता है। सप्ताह 4 और 13 के बीच, सेनेसेंस से जुड़े बीटा-गैलेक्टोसिडेस की उपस्थिति में उल्लेखनीय वृद्धि हुई है, यह सुझाव देते हुए कि सेलुलर सेनेसेंस, ऑर्गेनिस्मल उम्र बढ़ने का एक मान्यता प्राप्त चालक, संस्कृति में इस समय में हुआ है। सप्ताह 13 में ऑर्गेनोइड्स के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला होने से परिपक्व कॉर्टिकल न्यूरोनल मार्कर (सीटीआईपी 2) के साथ सह-लेबल वाले एक और सेनेसेंस मार्कर, पी 21 की उपस्थिति की पुष्टि हुई और चित्रा 4 बी में देखा जा सकता है। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि पी 21 की उपस्थिति सेल चक्र गिरफ्तारी का एक मार्कर है और अपने आप में सेनेसेंस का एक निश्चित मार्कर नहीं है, और पी 16 और एसएएसपी (सेनेसेंस से जुड़े स्रावी फेनोटाइप) कारकों जैसे सेनेसेंस के अन्य मार्करों का पता लगाने की सिफारिश की जाती है ताकि कोशिकाओं को निश्चित रूप से सेनेसेंट के रूप में पहचाना जा सके।

चित्रा 1: प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य कॉर्टिकल मस्तिष्क ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने के लिए योजनाबद्ध आरेख। फीडर मुक्त माध्यम में बनाए रखा एचपीएससी से कॉर्टिकल मस्तिष्क ऑर्गेनोइड की पीढ़ी के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रिया का योजनाबद्ध कार्यप्रवाह। वर्कफ़्लो ऑर्गेनोइड में 3 डी पैटर्न वाले कॉर्टिकल प्लेट मानव ऊतकों में 2 डी एचपीएससी को अलग करने के लिए शामिल छह चरणों का अवलोकन प्रदान करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 2: न्यूरोएक्टोडर्मल कॉलोनियों-एचपीएससी से प्राप्त तंत्रिका स्फेरॉइड की पीढ़ी (ए) मानव पीएससी की प्रतिनिधि छवियां इष्टतम (सफेद टिक) और विभेदित कॉलोनियों (सफेद क्रॉस) का प्रदर्शन करती हैं। स्केल बार: 200 μm, 4x आवर्धन। (बी) दोहरी एसएमएडी अवरोधक उपचार के 3 दिनों के बाद एचपीएससी से प्राप्त न्यूरोएक्टोडर्मल कॉलोनी की प्रतिनिधि छवि। स्केल बार: 200 μm, 4x आवर्धन। (सी) मानव पीएससी कॉलोनियों को न्यूरोक्टोडर्मल कॉलोनियों की ओर विभेदित किया गया था। छवियां एसओएक्स 2 (लाल), एनएएनओजी (ग्रीन) के साथ पीएससी (दिन 1 पर) और न्यूरोएक्टोडर्मल (दिन 3 पर) कॉलोनियों के धुंधला होने का प्रतिनिधित्व करती हैं, सभी नाभिक होचस्ट 33342 (नीले) के साथ काउंटरस्टेन किए गए थे। स्केल बार: 40 μm, 100x आवर्धन। (डी) ब्राइटफील्ड के तहत इन विट्रो में संस्कृति में समय के साथ कॉर्टिकल मस्तिष्क स्फेरॉइड के विकास के चरणों को दिखाने वाली छवियां, और दिन 1 पर एसओएक्स 2 (रेड) के साथ होलमाउंट इम्यूनोस्टेन, और दिन 4 में एसओएक्स 2 (लाल) और जेडओ 1 (ग्रीन) के साथ डबल इम्यूनोस्टेन। ब्राइटफील्ड छवि का स्केल बार 500 μm, 4x आवर्धन है, नीचे की छवियों के स्केल बार 40 μm, 20x आवर्धन हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 3: विभिन्न एचपीएससी लाइनों से प्राप्त कॉर्टिकल मस्तिष्क ऑर्गेनोइड की विशेषता (ए) जी 22, डब्ल्यूटीसी और ईयू 79 मानव आईपीएससी लाइनों से प्राप्त कॉर्टिकल मस्तिष्क ऑर्गेनोइड की प्रतिनिधि छवियां इन विट्रो में 3 सप्ताह से अधिक सुसंस्कृत हैं। सभी छवियों का स्केल बार 500 μm, 2x आवर्धन है। (बी) विभिन्न एचपीएससी लाइनों (जी 22, डब्ल्यूटीसी और ईयू 7 9) में इन विट्रो भेदभाव के 3 सप्ताह में कॉर्टिकल मस्तिष्क ऑर्गेनोइड की सफल पीढ़ी का प्रतिशत। एन = 3। डेटा को माध्य ± मानक विचलन के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। (सी) बार ग्राफ मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल लाइनों (जी 22, डब्ल्यूटीसी और ईयू 79) की विभिन्न लाइनों में इन विट्रो भेदभाव के सप्ताह 1 और 3 में कॉर्टिकल मस्तिष्क ऑर्गेनोइड (औसत व्यास के आधार पर) के विकास को दर्शाता है। एन = 3। डेटा को माध्य ± मानक विचलन के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। (डी) जी 22 एचपीएससी से प्राप्त 6 सप्ताह और 9 सप्ताह पुराने कॉर्टिकल मस्तिष्क ऑर्गेनोइड के वर्गों की प्रतिनिधि छवियां, वेंट्रिकल ज़ोन पैक्स 6 (लाल) और कॉर्टिकल प्लेट सीटीआईपी 2 (हरा) के लिए इम्यूनोस्टेन। सभी वर्गों को होचस्ट 33342 (नीला) के साथ काउंटरस्टेन किया गया था। स्केल बार = 140 μm, 20x आवर्धन। W सप्ताह है। (ई) डब्ल्यूटीसी एचपीएससी से प्राप्त 10-सप्ताह और 13-सप्ताह पुराने कॉर्टिकल मस्तिष्क ऑर्गेनोइड के वर्गों की प्रतिनिधि छवियां, कॉर्टिकल परत चतुर्थ एसएटीबी 2 (हरा) के लिए इम्यूनोस्टेन। सभी वर्गों को होचस्ट 33342 (नीला) के साथ काउंटरस्टेन किया गया था। 10 सप्ताह की छवि स्केल बार = 50 μm, 40x आवर्धन। 13 सप्ताह की छवि स्केल बार = 150 μm, 40x आवर्धन। W सप्ताह है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4: एचपीएससी से प्राप्त कॉर्टिकल मस्तिष्क ऑर्गेनोइड में सेनेसेंस की विशेषता (ए) डब्ल्यूटीसी एचपीएससी से प्राप्त मानव कॉर्टिकल मस्तिष्क ऑर्गेनोइड के वर्गों की प्रतिनिधि छवियां इन विट्रो में 4 और 13 सप्ताह के लिए सुसंस्कृत और एसए-β-गैल के साथ दाग। स्केल बार = 500 μm, ज़ूम की गई छवियों की स्केल बार = 250 μm, 4x आवर्धन। बिंदीदार बॉक्स एक आवर्धित छवि को इंगित करता है। (बी) मानव ईयू 79 एचपीएससी से प्राप्त 13 सप्ताह पुराने कॉर्टिकल मस्तिष्क ऑर्गेनोइड के वर्गों की प्रतिनिधि छवियां, कॉर्टिकल न्यूरॉन्स सीटीआईपी 2 (हरा) और पी 21 (लाल) के लिए इम्यूनोस्टेन। सभी वर्गों को होचस्ट 33342 (नीला) के साथ काउंटरस्टेन किया गया था। स्केल बार = 25 μm, ज़ूम की गई छवियों की स्केल बार = 10 μm, 40x आवर्धन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

मीडिया घटक	एकाग्रता
डीएमईएम पोषक तत्व मिश्रण एफ 12 10x 500 एमएल (डीएमईएम /
एन 2 पूरक 5 एमएल (100x)	1% पर सिमट गया
बी 27 पूरक 10 एमएल	2% पर पूरक
एमईएम गैर-आवश्यक अमीनो एसिड समाधान (100x)	1% पर पूरक
पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (10,000 यू /	1% पर पूरक
2-मर्काप्टोइथेनॉल 50 एमएल (1000x)	0.1% पर पूरक

तालिका 1: एन 2 मध्यम। तालिका एन 2 माध्यम तैयार करने के लिए आवश्यक अभिकर्मकों को सूचीबद्ध करती है।

मीडिया घटक	एकाग्रता
डीएमईएम पोषक तत्व मिश्रण एफ 12 10x 500 एमएल (डीएमईएम /	डीएम मीडिया डीएमईएम / एफ 12 और न्यूरोबेसल मीडिया के 1: 1 अनुपात के साथ बनाया गया है
न्यूरोबेसल मीडियम
एन 2 पूरक 5 एमएल (100x)	0.5% पर सिमट गया
बी 27 पूरक 10 एमएल	1% पर पूरक
एमईएम गैर-आवश्यक अमीनो एसिड समाधान (100x)	1% पर पूरक
ग्लूटामैक्स पूरक 100x	1% पर पूरक
पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (10,000 यू /	1% पर पूरक
इंसुलिन समाधान मानव पुनः संयोजक	मीडिया के 50 मिलीलीटर के लिए 12.5 μL
2-मर्काप्टोएथेनॉल 50 एमएल (1000x)	मीडिया के 50 मिलीलीटर के लिए 17.5 μL

तालिका 2: भेदभाव माध्यम (डीएम)। तालिका भेदभाव माध्यम तैयार करने के लिए आवश्यक अभिकर्मकों को सूचीबद्ध करती है।

पूरक वीडियो 1. "बीएफजीएफ के उपचार के तहत 3 डी में प्रेरित एचएनईसीटी 2 डी शीट / कॉलोनी रूपांतरण की लाइव इमेजिंग"। एचएनईसीटी की प्रेरित कॉलोनियों को धीरे-धीरे डिश से अलग किया गया था जैसा कि ऊपर उल्लिखित है और कम लगाव 6-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट में स्थानांतरित कर दिया गया है। 2 डी एचएनईसीटी कॉलोनियों को 12 घंटे के भीतर 3 डी एचएनईसीटी स्फेरॉइड में परिवर्तित कर दिया गया था। सीरियल छवियों को हर 5 मिनट में कैप्चर किया गया था। स्केल बार = 100 μm. कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

दवा स्क्रीनिंग और रोग मॉडलिंग में एचपीएससी-व्युत्पन्न मस्तिष्क ऑर्गेनोइड के उपयोग को सक्षम करने के लिए, प्रतिकृति और विश्वसनीय प्रोटोकॉल¹⁵ के बाद ऑर्गेनोइड बनाना महत्वपूर्ण है। मस्तिष्क ऑर्गेनोइड आमतौर पर एचपीएससी से प्राप्त भ्रूण निकायों से उत्पन्न होते हैं, जो तब एक बाह्य मैट्रिक्स में एम्बेडेड होते हैं जो ऊतक विस्तार और तंत्रिका भेदभाव को बढ़ावा देते हैं। लैंकेस्टर के^1,16,17 और वेलास्को¹⁸ जैसे प्रोटोकॉल की तुलना में, जो भ्रूण निकायों से शुरू होते हैं और विकासशील ऑर्गेनोइड द्वारा डिफ़ॉल्ट भेदभाव मार्ग का पालन करने की अनुमति देते हैं, हमने पाया है कि भ्रूण निकायों के बजाय मानव एनईसीटी कोशिकाओं के साथ कॉर्टिकल मस्तिष्क ऑर्गेनोइड निर्माण शुरू करने से कॉर्टिकल ब्रेन ऑर्गेनोइड गठन की स्थिरता में सुधार होता है। इसके परिणामस्वरूप दवा और फेनोटाइपिक स्क्रीनिंग के लिए आवश्यक स्केलिंग की भी अनुमति मिलती है। चूंकि मानव एनईसीटी कोशिकाओं को न केवल काफी मात्रा में विस्तारित किया जा सकता है, बल्कि आसानी से क्रायोप्रिजर्व भी किया जा सकता है, इसलिए यह दृष्टिकोण प्रयोगों के बीच प्रतिकृति में भी सुधार करता है। यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि, बायोरिएक्टर और इसी तरह की प्रौद्योगिकियों के उपयोग को अपनाने वाले अन्य प्रोटोकॉल की तुलना में, इस प्रोटोकॉल के लिए कोई विशेष उपकरण की आवश्यकता नहीं है, जिससे यह किसी भी प्रयोगशाला⁶ के लिए उपयुक्त हो जाता है। अंत में, परिपक्व ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने के लिए आवश्यक समय जो एसएटीबी 2 जैसे कॉर्टिकल लेयर मार्करों के लिए सकारात्मक हैं, लैंकेस्टर 1 और बायोरिएक्टर प्रोटोकॉल 6,19 दोनों की तुलना में कम हो जाता है, जिससे यह स्वास्थ्य और बीमारियों ^1,6,16 में मानव कॉर्टिकल विकास के विकास प्रक्षेपवक्र का अध्ययन करने के लिए अधिक उपयुक्त हो जाता है।

इसके अलावा, मनोभ्रंश जैसे उम्र बढ़ने से संबंधित बीमारियों के लगातार बढ़ते वैश्विक स्वास्थ्य देखभाल प्रभाव को देखते हुए, जो मस्तिष्क में सेनेसेंट सेल प्रकारों में वृद्धि से जुड़े होते हैं जो रोगजनन में योगदान देते हैं, यौगिकों की पहचान करने और परीक्षण करने की क्षमता जो मस्तिष्क की उम्र बढ़ने में सुधार कर सकते हैं, भारी रुचि रखते हैं। रीप्रोग्रामिंग प्रक्रिया²⁰ के दौरान एचपीएससी को एपिजेनेटिक रूप से कायाकल्प करने के लिए जाना जाने के बावजूद, हम लंबे समय तक सुसंस्कृत कॉर्टिकल मस्तिष्क ऑर्गेनोइड में सेनेसेंट कोशिकाओं में मजबूत वृद्धि पाते हैं। यह एक आशाजनक विकास है जो अब दवाओं की स्क्रीनिंग को सक्षम बनाता है जो मस्तिष्क (सेनोलिटिक्स) से ऐसी सेनेसेंट कोशिकाओं को खत्म करते हैं या जो इस प्रक्रिया को धीमा कर देते हैं (सेनोस्टैटिक्स)²¹। चूंकि मानव एनईसीटी-व्युत्पन्न कॉर्टिकल मस्तिष्क ऑर्गेनोइड मानव मूल के हैं, इसलिए यह दृष्टिकोण संभवतः इस तरह के उपन्यास चिकित्सीय के विपणन के लिए पारंपरिक मार्ग को छोटा कर देगा।

इस प्रोटोकॉल में दो महत्वपूर्ण चरण हैं। पहला भेदभाव के समय एचपीएससी कॉलोनियों की संगम का सही स्तर है। एचपीएससी कॉलोनियों को यह सुनिश्चित करने के लिए अधिकतम 30% संगम होना चाहिए कि उत्पन्न एनईसीटी कॉलोनियां पड़ोसी कॉलोनियों के साथ फ्यूज न हों और व्यक्तिगत ऑर्गेनोइड क्लोनली संचालित हों। दूसरे महत्वपूर्ण चरण में एनईसीटी कॉलोनियों को उठाने और तंत्रिका स्फेरॉइड का उत्पादन करने के लिए डिस्पेस का सही उपयोग शामिल है। विघटन के साथ इनक्यूबेशन का समय उत्पन्न तंत्रिका स्फेरॉइड की अंतिम गुणवत्ता के लिए महत्वपूर्ण है। ऐसा इसलिए है क्योंकि विघटन के साथ कॉलोनियों का अधिक जोखिम कोशिकाओं²² के लिए विषाक्त है और अंततः उत्पन्न ऑर्गेनोइड की गुणवत्ता को प्रभावित करता है। इस प्रोटोकॉल की सीमा यह है कि तंत्रिका स्फेरॉइड के आकार को नियंत्रित करना मुश्किल है क्योंकि यह प्रारंभिक कॉलोनियों के आकार पर निर्भर है जो विघटन के साथ उठाए जाते हैं। हालांकि, एम्बेडिंग चरण में आगे बढ़ते समय एक समान आकार के तंत्रिका स्फेरॉइड का चयन करके इस समस्या को दूर किया जा सकता है।

अंत में, भविष्य के अनुप्रयोग रोबोटिक विश्लेषण और बायोफार्मास्यूटिकल स्क्रीनिंग दृष्टिकोणों में इन प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य कॉर्टिकल ऑर्गेनोइड के उपयोग के लिए विस्तारित हो सकते हैं जो आमतौर पर उस उद्योग में उपयोग किए जाते हैं। यह हमारी प्रयोगशाला से प्रारंभिक डेटा द्वारा समर्थित है जो दर्शाता है कि मानव एनईसीटी कोशिकाओं से कॉर्टिकल मस्तिष्क ऑर्गेनोइड की पीढ़ी को आसानी से स्वचालित किया जा सकता है, जिससे यह इन दृष्टिकोणों के साथ संगत हो जाता है।

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

यह काम मेडिकल रिसर्च फ्यूचर फंड-एक्सीलेरेटेड रिसर्च, ल्यूकोडिस्ट्रॉफी फ्लैगशिप मासिमो मिशन (ईपीसीडी000034), मेडिकल रिसर्च फ्यूचर फंड-स्टेम सेल मिशन (एपीपी 2007653) द्वारा समर्थित है। लेखक पूरक वीडियो 1 में डेटा उत्पन्न करने के लिए डॉ जू-ह्यून ली (कोरिया विश्वविद्यालय) को धन्यवाद देना चाहते हैं।

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% Formaldehyde (W/V) Methanol-free	Thermo Fisher Scientific	28908	4% of PFA are diluted in 1x PBS
2-Mercaptoethanol 50 mL(1000x)	Life Technologies Australia (TFS)	21985023	Used in NM and DM media
B 27 Supplement 10 mL	Life Technologies Australia (TFS)	17504044	Used in NM and DM media
CKX53 microscope with SC50 camera	Olympus
Corning Costar 6 well cell culture plates	Sigma Aldrich Pty Ltd	CLS3516-50EA
Dispase II powder	Thermo Fisher Scientific	17105041	Powder is dissolve in HBSS, filtered through 0.22 µm filter, aliquote at 10 mL and store at -20 °C
DMEM Nutrient Mix F12 10x 500 mL (DMEM/F-12)	Thermofisher	11320082	Used in NM and DM media
DMSO Dimethyl Sulfoxide	Sigma Aldrich Pty Ltd	D2650-100ML
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma Aldrich Pty Ltd	D1408-500ML
Falcon Matrigel hESC-qualified Matrix	In Vitro Technologies Pty Ltd	FAL354277	Make aliquotes of 100 µL and stored at -20 °C
GlutaMAX Supplement 100x	Thermo Fisher Scientific	35050061	Used in NM and DM media
Hanks Balanced Salt Solution	Sigma Aldrich Pty Ltd	H8264
Human induced pluripotent stem cells (EU79)			In-house reporogrammed from skin fibroblast
Human induced pluripotent stem cells (G22)	Genea Biocells		Obtained from Genea Biocells (San Diego, United States)
Human induced pluripotent stem cells (WTC)			Gift from Professor Bruce Conklin
InSolution TGF-Β RI Kinase Inhibitor VI, SB431542	Merck	US1616464-5MG
Insulin Solution Human Recombinant	Sigma Aldrich Pty Ltd	I9278	Used in NM and DM media
LDN193189 Dihydrochloride	Sigma Aldrich Pty Ltd	SML0559-5MG	Used during differentiation
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Thermo Fisher Scientific	11140050	Used in NM and DM media
mTeSR Plus	STEMCELL TECHNOLOGIES	100-0276	Used to maintain hiPSC colonies prior to differentiation with NM media
N2 Supplement 5 mL (100x)	Life Technologies Australia Pty Ltd	17502048	Used in NM and DM media
Neurobasal Medium	Thermo Fisher Scientific	21103049	Used in DM media
OCT Embedding Compound Sakura Clear (118 mL/Bottle)	Tissue Tek	4583
Parafilm M Roll Size 4 in. x 125 Ft	Sigma Aldrich Pty Ltd	P7793
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122	Used in NM and DM media
Potassium Hexacyanoferrate (II) Trihydrate	Sigma Aldrich Pty Ltd	CP1087
Potassium hexacyanoferrate(III)	Sigma Aldrich Pty Ltd	455946
Prolong Glass Antifade Mountant	Life Technologies Australia (TFS)	P36980
Recombinant Human FGF basic	R&D Systems	233-FB-01M	Aliquotes are made at 20 µg/mL and stored at -20 °C
SB431542	Tocris	1614	Used during differentiation
Sucrose	Sigma Aldrich Pty Ltd	PHR1001-1G	30% of sucrose are diluted in 1x PBS
Ultra-Low attachment multiwell plates , 24 well plate, polystyrene	Sigma Aldrich Pty Ltd	CLS3473-24EA
X-GAL EA	Life Technologies Australia (TFS)	R0404	Make aliquotes of 20 mg/mL and storde at -80 °C

Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nature Biotechnology. 36 (5), 432-441 (2018).
Xiang, Y., et al. Fusion of regionally specified hPSC-derived organoids models human brain development and interneuron migration. Cell Stem Cell. 21 (3), 383-398 (2017).
Bagley, J. A., Reumann, D., Bian, S., Lévi-Strauss, J., Knoblich, J. A. Fused cerebral organoids model interactions between brain regions. Nature Methods. 14 (7), 743 (2017).
Kwak, T. H., et al. Generation of homogeneous midbrain organoids with in vivo-like cellular composition facilitates neurotoxin-based Parkinson's disease modeling. Stem Cells. 38 (6), 727-740 (2020).
Qian, X., et al. Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells. Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).
Shaker, M. R., Cooper-White, J., Wolvetang, E. J. Self-organizing 3D human choroid plexus-ventricle-cortical organoids. BioRxiv. , (2020).
Shaker, M. R., Aguado, J., Chaggar, H. K., Wolvetang, E. J. Klotho inhibits neuronal senescence in human brain organoids. npj Aging and Mechanisms of Disease. 7 (1), 1-12 (2021).
Shaker, M. R., et al. Anteroposterior Wnt-RA gradient defines adhesion and migration properties of neural progenitors in developing spinal cord. Stem Cell Reports. 15 (4), 898-911 (2020).
Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
Shaker, M. R., et al. Rapid and efficient generation of myelinating human oligodendrocytes in organoids. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 631548 (2021).
Lee, J. -. H., Shaker, M. R., Lee, E., Lee, B., Sun, W. NeuroCore formation during differentiation of neurospheres of mouse embryonic neural stem cells. Stem Cell Research. 34, 101691 (2020).
Shaker, M. R., et al. Spatiotemporal contribution of neuromesodermal progenitor-derived neural cells in the elongation of developing mouse spinal cord. Life Sciences. 282, 119393 (2021).
Shaker, M. R., et al. Neural epidermal growth factor-like like protein 2 Is expressed in human oligodendroglial cell types. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 803061 (2022).
Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
Giandomenico, S. L., Sutcliffe, M., Lancaster, M. A. Generation and long-term culture of advanced cerebral organoids for studying later stages of neural development. Nature Protocols. 16 (2), 579-602 (2021).
Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
Qian, X., et al. Brain-region-specific organoids using mini-bioreactors for modeling ZIKV exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
Hunter, Z. L., Leeson, H. C., Shaker, M. R., Wolvetang, E. J., Vadlamudi, L. Human induced pluripotent stem cells generated from epilepsy patients for use as in vitro models for drug screening. Stem Cell Research. 60, 102673 (2022).
Kaur, A., Macip, S., Stover, C. M. An appraisal on the value of using nutraceutical based senolytics and senostatics in aging. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 218 (2020).
Wang, F., et al. Safety and efficacy of dispase and plasmin in pharmacologic vitreolysis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (9), 3286-3290 (2004).