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要約

このプロトコルでは、市販の試薬と機器を使用した質量分析 による シングルセルプロテオミクス分析用の哺乳類細胞を調製する方法を説明し、手動および自動ピペッティングの両方のオプションを提供します。

要約

シングルセルプロテオミクス解析には、高感度で定量的に正確で、広くアクセス可能で堅牢な方法が必要です。これらの要件を満たすために、シングルセルプロテオミクス(SCoPE2)プロトコルは、限られたサンプルから数百から数千のタンパク質を単一細胞レベルまで定量するための第2世代の方法として開発されました。この方法を用いた実験により、1,500個の哺乳類細胞(細胞あたり500〜1,000個のタンパク質)にわたって3,000を超えるタンパク質を10日間の質量分析計装置で定量することを達成しました。SCoPE2は、細胞溶解に凍結熱サイクルを活用することで、単一細胞のクリーンアップの必要性を排除し、その結果、サンプル損失を低減すると同時に、サンプル調製を迅速化し、自動化を簡素化します。さらに、この方法では同重体キャリアを使用しているため、タンパク質の同定が容易になり、サンプルの損失が減少します。

このビデオプロトコルは、広くアクセス可能な機器と試薬のみを使用した自動シングルセルタンパク質分析の採用を可能にするための詳細なガイダンスを提供します。採取から注入、液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析(LC-MS/MS)分析まで、プロテオミクス解析用の単一細胞を調製する手順における重要なステップを示します。さらに、視聴者は、同重体担体を用いた実験計画の原則、等圧担体と単一細胞調製物の両方の品質管理、およびアプローチの限界についての議論を伴う代表的な結果を通して導かれます。

概要

シングルセル解析は、バルク測定では識別できない生物学的システム内の不均一性のレベルを研究するために広く使用されています1,2,3。このような細胞の多様性は、癌細胞の治療抵抗性4,5,6から糖尿病における細胞間不均一性7,8,9,10まで、不可欠な生物学的プロセスの理解を促進することができる機能的結果をもたらす可能性がある。多くの研究は、遺伝的またはトランスクリプトームレベルを測定することによって、単一細胞中の核酸を測定することに焦点を当てており、細胞の種類と状態の分類を可能にしました。しかし、核酸空間におけるこのような進歩は、転写後制御11の知識ギャップを埋めることができず、単一細胞における同様にハイスループットなタンパク質測定の必要性を推進している12、13、14、15。

私たちは、哺乳類系の厳密で堅牢なシングルセルプロテオミクスの需要に対応するために、SCoPE216,17を開発しました。これは多重化された方法であり、一度に1つの細胞を分析するラベルフリーのmthodとは対照的に、多くの細胞を並行して標識および分析することによりスループットを向上させることができます18,20。サンプル調製方法、質量分析アプローチ、およびその後のデータ分析ステップにより、単一細胞あたり数百から数千のタンパク質を正確に定量できます。この方法は、対象とする単一細胞集団と生物学的に類似している細胞の小さなバルクサンプル(通常25〜200)である同重体担体21を介して単一細胞の質量分析を可能にする。このキャリア材料は、タンデム質量タグ(TMTラベル)を使用して、同じ材料と単一セルの基準チャネルとのセットで多重化されます。キャリアチャネルは、サンプルの損失を表面積まで低減し、ペプチド同定を成功させるためのイオンバックボーンフラグメントを提供します。バルクで調製され、その後、各単一細胞セットに対して5〜10細胞当量に希釈される参照チャネルは、分析における技術的な変動性を制御するのに役立ちます。具体的には、このリファレンスにより、イオンサンプリングやイオン化効率など、LC-MS/MS関連の影響によって引き起こされる変動性の正規化が可能になります。通常、基準チャネルとキャリアチャネルは同じ細胞集団から作られます。

このサンプル調製プロトコルは、SCoPE-MS22をベースに複数の相乗的な改良を加えた第2世代のメソッドです。改善には、MSプロテオミクス調製の一般的なステップであるサンプルクリーンアップを回避する細胞溶解法が含まれます。凍結熱溶解法であるmPOP(最小プロテオミックサンプル調製)23を使用しています。この方法では、バイアルではなく、少量およびマルチウェルプレートでの単一細胞の溶解が可能になり、より高いスループットレートとサーマルサイクラーによる自動化が容易になりました。全体として、この方法はSCoPE-MS16,24と比較して、単一細胞あたりのコストを削減し、定量精度を向上させました。

このプロトコルでは、TMTpro 18-plexアイソバリック標識を使用してキャリアチャネルとリファレンスチャネルを準備する方法など、プロテオミクス解析用のシングルセルを準備する方法について説明します。シングルセル懸濁液中であり、384ウェルプレートに単離できる哺乳類細胞は、このプロトコルに適している可能性があります。また、成功したシングルセルセットの代表的な結果も含まれており、R ShinyアプリDO-MS25によって生成されたいくつかの品質管理プロットが表示されます。他の公開されたソフトウェアツール26、27および実験ガイドライン17、21は、このプロトコルの採用を改善した。このビジュアルガイドが、研究者がシングルセルプロテオミクス実験を行うのにさらに役立つことを願っています。

プロトコル

注意: このプロトコルでは、室温(RT)は18〜22°Cです。

1. キャリアと標準物質の生成

  1. 細胞単離
    1. 目的の細胞を氷冷した1x PBSで細胞懸濁液に集めます。
      注:可能であれば、キャリアと標準物質は、単一細胞レベルで研究するために選択された細胞集団から調製する必要があります。異なる実験条件からの同数の細胞(刺激免疫細胞および非刺激免疫細胞など)が担体および基準を構成するはずである。十分な数のこれらの細胞を採取できない状況では、生物学的類似性に基づいて適切な細胞集団を選択する必要があります。
    2. 血球計算盤または他の細胞計数手段(FACSなど)を使用して、懸濁液中の細胞数をカウントします。
    3. 各細胞タイプの22,000細胞を11 μLのHPLCグレードの水にスピンダウンし、PCRチューブ(標準250 μL PCRチューブ)に別々に再懸濁します。
      注:ここでアドバイスされている細胞の数は、キャリアと、単一細胞でいっぱいの384ウェルプレートから調製できるセット数の参照に十分です。このステップの細胞インプットと後続のステップの試薬量は、セット数が多いほど比例してスケーリングできます。スピンダウンの速度は、ラボの細胞培養方法によって異なります。典型的なスピンダウン:5分間で300 × g 。
    4. サンプルを-80°Cの冷凍庫に少なくとも30分間移します。
      一時停止ポイント:サンプルは数ヶ月間凍結したままで、単一細胞データに影響はありません。
  2. 細胞溶解
    1. 細胞を入れたPCRチューブを90°Cで10分間加熱し(サーマルサイクラーの蓋を105°Cに設定)、加熱サイクルの直後にチューブを12°Cまで冷却します。
    2. チューブを短時間ボルテックスしてから、RTのベンチトップPCRチューブスピナーでスピンダウンして、チューブの底にあるすべての液体を収集します。
    3. 水浴超音波処理器では、5分間チューブを超音波処理し、RTで氷上に置きます。
  3. トリプシン消化
    1. 氷上で2.2 μLのマスターミックス(成分については 表1 を参照)を各サンプルチューブに加えます。
      注意: トリプシンは、皮膚、呼吸器、および目の炎症を引き起こす可能性があります。必ず個人用保護具を着用してください。化学ヒュームフードの下でハンドルします。
    2. チューブを短時間ボルテックスして混合し、RTのベンチトップPCRチューブスピナーでスピンダウンし、各チューブの下部にあるすべての液体を収集します。
    3. サンプルを37°Cで3時間加熱します(サーマルサイクラーの蓋を52°Cに設定)。
  4. TMT標識反応
    1. 消化後、RTのベンチトップPCRチューブスピナーでサンプルをスピンダウンします。
    2. 各サンプルをそれぞれ6.6 μLの2つの等容量に分割し、各チューブに11,000個の細胞が含まれるようにします。
    3. 担体用のチューブに、85 mMの濃度で再懸濁したTMT標識126を3.3 μL添加します。
    4. 参照用のチューブに、85 mMの濃度で再懸濁したTMT標識127Nを3.3 μL加えます。
    5. チューブを短時間ボルテックスし、RTのベンチトップPCRチューブスピナーでスピンダウンして、下部に液体を収集します。
    6. チューブをRTで1時間放置します。
  5. TMT標識反応のクエンチング
    1. 1.65 μLの0.5%ヒドロキシルアミンを各チューブに加えます。
      注意: ヒドロキシルアミンは皮膚の炎症を引き起こす可能性があります。必ず個人用保護具を着用してください。
    2. チューブを短時間ボルテックスし、RTのベンチトップPCRチューブスピナーでスピンダウンして、下部に液体を収集します。
    3. チューブをRTで30分間放置します。
  6. キャリアとリファレンスの組み合わせ
    1. キャリアを構成するサンプルが個別にラベル付けされている場合は、それらを同じ比率で混合します。
    2. 参照を構成するサンプルが個別にラベル付けされている場合は、それらを同じ比率で混合します。
    3. 担体の最終濃度が100〜200細胞/μL、基準濃度が5〜10細胞/μLになるように担体と基準を混合します。
    4. キャリアと標準物質をシングルセルセットと組み合わせる前に、品質を評価します。
      注:キャリアと標準物質の品質管理はさまざまな方法で実行できますが、do-ms.slavovlab.net17で入手可能なDO-MSソフトウェアを使用することをお勧めします。品質の重要な測定値には、ミスカット率(<25%、切断が欠落した確実に同定されたペプチドの数を合計で割って計算されるメトリック)および標識効率(>99%、標識部位の数、すなわちペプチドN末端とリジンを標識部位の総数で割ったものとして計算される測定基準)が含まれます。
      一時停止ポイント:キャリアと標準物質は、必要になるまで-80°Cで保存できます。
コンポーネントミックス濃度チューブあたりの最終濃度
トリプシンゴールド50 ng/μL8.33 ng/μL
ティーブ、pH = 8.5500ミリメートル83.33 ミリ
ベンゾナーゼヌクレアーゼ1.2単位0.2単位

表1:マスターミックスの試薬量。 トリプシン消化に必要な試薬の最終濃度がリストされています。

2. SCoPE2サンプル調製

  1. 細胞単離
    1. HPLCグレードの水に、合成ペプチド溶液1μLあたりペプチドあたり25 fmolを補給します。
      注:ウォーターズのMassPrepペプチド溶液は、使用できるものの一例です。それはあまりよくイオン化しない7つのペプチドで構成されています。これはこのソリューションの重要な側面です:これらのペプチドは、単一細胞の正確な質量分析定量を妨げません。目的のサンプルに含まれる可能性が低い少数のペプチドの高度に精製された混合物が適切です。
    2. 液体分注ロボットまたは手動ピペットを使用して、この混合物を384ウェルプレートの各ウェルに1 μL加えます。
    3. プレートを密封し、RTのベンチトッププレートスピナーで回転させて、底部に液体を集めます。
      一時停止ポイント:この溶液を含むプレートは、必要になるまで-80°Cで保存できます。
    4. 脱凝集した未固定細胞の懸濁液を得る。
      注:細胞懸濁液がどの程度正確に得られるかは、目的の細胞タイプに基づいています。大まかな例を次に示します。
      1. 浮遊細胞:細胞をスピンダウンしてペレットにし、細胞培養培地を除去します。
      2. 接着細胞:トリプシン処理または掻き取りによってディッシュまたはフラスコから細胞を取り除きます。次に、それらを回転させて細胞培養培地を除去します。
    5. 細胞懸濁液を1x氷冷PBSで2回洗浄します。2回目の洗浄後、細胞を1x PBSに懸濁したままにします。
    6. 384ウェルプレートが凍結している場合は、RTで解凍し、すべての液体がウェルの底にあることを確認するためにスピンダウンします。
    7. セルソーターまたは手動ハンドピッキングなどの他の利用可能な手段を使用して、単一の細胞をそれぞれのウェルに分配します。
      注:ネガティブコントロールとポジティブコントロールのためにいくつかのウェルを空のままにして、ウェルに単一セルを追加します(説明を参照)。フローサイトメトリーを使用する場合は、フローサイトメーターの流量をできるだけ低くしてください。流量が少ないほど、細胞の取り扱いに優しいと考えられています。さらに、ノズルサイズは、目的のセルでの使用に適している必要があります。フローサイトメトリー施設との連携をお勧めします。
    8. 2〜5個の細胞当量ライセートのポジティブコントロールを、手動またはリキッドハンドリングロボットでピペットで選択したウェルに追加します。
    9. RTのベンチトッププレートスピナーで選別されたセルでプレートを密封してスピンダウンし、底部に液体を収集します。できるだけ早くプレートを-80°Cで凍結します。
      一時停止ポイント:選別された単一セルを含むプレートは、必要になるまで-80°Cで保存できます。
  2. 細胞溶解
    1. 選別された単一セルを含む384ウェルプレートを取り、できるだけ早くサーマルサイクラーに入れます。
    2. プレートを90°Cに10分間加熱し(蓋の温度を105°Cに設定して)、プレートを12°Cに冷却します。
    3. RTのベンチトッププレートスピナーでプレートを簡単に回転させます。
    4. 水浴超音波処理器では、RTで5分間プレートを超音波処理し、氷の上に置きます。
  3. トリプシン消化
    1. 384ウェルプレートあたり100 μLのマスターミックス(成分については 表1 を参照)を調製します。
    2. 384ウェルプレートの各ウェルに、リキッドハンドラーを使用してステップ2.3.1で調製したマスターミックス0.2 μLを加えます。
      注:手動ピペッティングを使用する場合は、より大きな容量を使用し、試薬の最終濃度がウェルごとに同じであることを確認してください。
    3. プレートをシールし、5秒間ボルテックスし、RTのベンチトッププレートスピナーでスピンダウンします。
    4. 384ウェルプレートを37°C(蓋の温度を52°Cに設定)で3時間加熱します。
  4. TMT標識反応
    1. 85 mMのTMTラベル(128Nから135N)のストックを-80°Cの冷凍庫から取り出します。チューブを開く前に、チューブを室温に温めてください。
    2. 無水アセトニトリルでラベルを22 mMに希釈します。
      注意: アセトニトリルは可燃性の液体です。皮膚、目、気道、中枢神経系を刺激する可能性があります。必ず個人用保護具を着用してください。化学ヒュームフードの下でハンドルします。
    3. この標識戦略を使用して、0.5 μLの希釈TMT標識を384ウェルプレートの各ウェルに追加します。液体分注ロボット(リキッドハンドラーを使用する場合は、必ず有機溶剤に適した関連機器を使用してください)または手動ピペットを使用してください。
      注: ラベル付けの方法については 、表 2 を参照してください。プレートレイアウトの例については 、表3 を参照してください。
    4. プレートをシールし、5秒間ボルテックスし、RTのベンチトッププレートスピナーでスピンダウンします。
    5. 標識反応をRTで1時間進行させます。
  5. TMT標識反応のクエンチング
    1. 384ウェルプレートの各ウェルに、リキッドハンドラーを使用して0.2 μLの0.5%ヒドロキシルアミン(HPLCグレードの水で希釈)を加えます。
      注:手動ピペッティングを使用する場合は、より大きな容量を使用し、試薬の最終濃度がウェルごとに同じであることを確認してください。
    2. プレートをシールし、5秒間ボルテックスし、RTのベンチトッププレートスピナーでスピンダウンします。
    3. プレートをRTに30分間保ちます。
  6. LC-MS/MS分析の準備:単一細胞およびコントロールウェルと担体/標準物質の組み合わせ
    1. 組み合わせたキャリア/標準物質を-80°Cの冷凍庫から取り出します。
    2. 各セットについて、1 μLの担体と標準物質を、1つのセットの一部となる最初のウェルにピペットで入れます。最初のウェルの全容量を後続のウェルにピペットで入れます。1つのセットに含まれるすべてのウェルが最終的なウェルに結合されるまで、1つのセルから次のセルに全容量をピペッティングし続けます。
      注:担体と標準物質はそれぞれ200細胞と5細胞相当の濃度である必要がありますが、前述のように21、これらの量は異なる場合があります。各セットには、標識戦略( 表2を参照)で概説されているように、TMTpro-16plexまたはTMTpro-18plexを使用する場合は、それぞれキャリア、リファレンス、および最大12または14のシングルセルまたはコントロールサンプルが含まれている必要があります(ステップ2.4.3を参照)。
    3. 各セットについて、5 μLの50%アセトニトリル(HPLCグレードの水で希釈)を、各セットに含める最初のシングルセルウェルに追加します。最初の井戸から次の井戸までの全量をピペットします。1つのセットに含まれるすべてのウェルが最終的なウェルに結合されるまで、1つのセルから次のセルに全容量をピペッティングし続けます。
      注:この洗浄ステップは、ウェルからのサンプル回収に役立ちます。
    4. 各セットを個々のオートサンプラーガラスインサートに移します。
      注:これらのセットは、384ウェルプレートの単一ウェルに組み合わせて、注入28用のオートサンプラーに直接配置することもできます。
    5. すべてのセットを組み合わせてガラスインサートに入れたら、サンプルを乾燥させます。
      一時停止ポイント:乾燥したセットは、質量分析計で実行する前に、少なくとも80°Cで1週間保存できます。
    6. LC-MS/MS分析の前に、1.2 μLの0.1%ギ酸(HPLCグレードの水で希釈)を各セットに追加して、標識ペプチドを再懸濁します。
      注意: ギ酸は可燃性の液体です。深刻な目の損傷や皮膚の火傷を引き起こす可能性があります。必ず個人用保護具を着用してください。換気の良い場所で取り扱ってください。
    7. オートサンプラーインサートをガラスオートサンプラーバイアルに入れ、各サンプルをキャップで閉じます。
    8. 各バイアルを5秒間ボルテックスして再懸濁が完了したことを確認してから、RTでバイアルスピナーでスピンダウンします。
    9. 各サンプルが側面に飛び散るのではなく、インサートの下部にあることを確認してください。
    10. バイアルをオートサンプラートレイに入れます。
    11. 各セットについて、LC-MS/MS分析用に1 μLを注入します。
ラベル126127N127°C128N128°C129N129°C130N130°C....135N
サンプルタイプキャリア参考空空SC/コントロールSC/コントロールSC/コントロールSC/コントロールSC/コントロール....SC/コントロール

表 2: SCoPE2 TMTpro-18プレックス ラベリング方式の例。 キャリアとリファレンスは通常、最初の2つのTMTラベルでラベル付けされています。次に、次の2つのラベルは、定量の精度を低下させる可能性のある同位体汚染のためにスキップされます。残りのラベルは、単一のセルまたはコントロール用です。

128°C129N129°C130N130°C131N131°C132N132°C133N133°C134N128°C129N129°C130N130°C131N131°C132N132°C133N133°C134N
123456789101112131415161718192021222324
あるティッカーティッカー-ティッカーティッカーティッカーティッカーティッカー+ティッカーティッカーティッカーティッカーティッカーティッカーティッカーティッカーティッカー-ティッカー+ティッカーティッカーティッカー
Bティッカー+ティッカーティッカーティッカーティッカーティッカーティッカーティッカーティッカー+ティッカーティッカーティッカーティッカーティッカーティッカーティッカーティッカーティッカー-ティッカーティッカー+
Cティッカー-ティッカー-ティッカーティッカーティッカー+ティッカー-ティッカーティッカーティッカーティッカー+ティッカー-ティッカーティッカーティッカーティッカーティッカーティッカー-
Dティッカーティッカーティッカーティッカーティッカーティッカー-ティッカーティッカーティッカーティッカー+ティッカー-ティッカーティッカーティッカーティッカーティッカーティッカーティッカーティッカーティッカーティッカー
Eティッカーティッカーティッカーティッカーティッカーティッカーティッカーティッカーティッカーティッカーティッカーティッカーティッカーティッカー+ティッカーティッカーティッカーティッカーティッカー-ティッカーティッカー
Fティッカーティッカーティッカーティッカーティッカーティッカーティッカーティッカー-ティッカーティッカーティッカーティッカー+ティッカーティッカーティッカー+ティッカーティッカーティッカー+ティッカーティッカー
Gティッカーティッカーティッカー+ティッカーティッカーティッカーティッカーティッカーティッカーティッカーティッカーティッカーティッカーティッカーティッカーティッカーティッカーティッカー-ティッカーティッカーティッカーティッカー
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表3:TMTpro-16plexを使用したラベリングのプレートレイアウトの例。 384ウェルプレートフォーマット(または他のプレートフォーマット)を使用して、細胞がソートされるウェルをランダム化することが重要です。TMTpro-18plexには別のプレートレイアウトが使用されます。

結果

プロトコルからの肯定的な結果は、プロトコル内のいくつかの重要なステップが正常に実行されたことを確認することを伴います。これらには、担体の調製、シングルセル単離、溶解、消化、バーコード標識、およびMSパラメータの最適化が含まれます。DO-MSプロットにより、プロトコルの各重要なステップの完了を簡単に評価できます。正常に調製された担体は、通常、量(セットあたり)で25および200細胞に相当し、よく消化され、よく標識されています。DO-MSのプロットにより、サンプルの強度(量を推定するため)、消化効率(理想的には<25%のミスカット)、および標識効率(>99%である必要があります)を定量化できます。最も重要なのは、完全に標識されていないキャリアサンプルは、単一細胞を対象としたバーコードとの交差反応を可能にし、単一細胞ペプチドの定量に偽のシグナルを追加する可能性があることです。

陰性対照ウェルには、すべての実験試薬が含まれていますが、細胞がありません。これにより、バックグラウンドノイズを評価するだけでなく、空のウェルの代表的なシグナルを提供することによって細胞分離効率も決定できます。DO-MSレポートは、単一細胞ウェルと一緒にコントロールウェルの測定シグナルを評価し、細胞分離とバックグラウンドノイズの成功を判断するためのプロットを提供します。さらに、定量の質は、SCoPE2パイプライン(GitHub:github.com/SlavovLab/SCoPE2 で入手可能)またはSCPバイオコンダクターパッケージ29を使用して評価できます。

単一細胞の消化および標識効率は、担体のように直接アッセイされない場合もあるが、DO-MSは、消化および標識効率の推定を可能にするプロットを再び提供する。単一細胞の調製と並行して100〜200細胞のコントロールを含める(すなわち、すべて同じ試薬添加を受ける)ことにより、そのコントロールの消化および標識効率を評価し、一緒に調製された単一細胞によって共有されると仮定することができる。消化不良は、完全に切断されたペプチドに対する切断されたペプチドの強度の比率が高いことによって示されます(図1)。

セットで考慮すべき別の要素は、各TMTチャネルの欠損データの割合とレポーターイオン強度の中央値です(図2)。単一細胞が正常に調製されると、細胞およびポジティブコントロールあたりの欠損データの量は、ネガティブコントロールサンプルよりもはるかに少なくなります。同様に、前駆体の強度の中央値は、ネガティブコントロールよりも単一細胞およびポジティブコントロールではるかに高くなります。MSパラメータの最適化は、他の場所で広く議論されており21、最適なパラメータは、DO−MSまたはSCPコンパニオン25,27などのツールを使用して決定することができる。

figure-results-1542
図1:キャリア調製の品質管理。 DO-MSプロットは、(A)TMTによる標識部位(リジンの側鎖上の第一級アミンおよびペプチドN末端)での正常調製担体の標識効率、および(B)トリプシン切断のアミノ酸残基における消化効率を示すプロットです。略称: TMT = タンデム質量タグ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:シングルセル調製の品質管理。 DO-MSプロットは、(A)単一細胞(C5-10)、コントロール(C13、16)、キャリア(C1)、および参照(C2)の欠損データの割合、および(B)単一セルおよびコントロールの強度を示しています。C3、C4、C11、C12、およびC15に対応するタグ127C、128N、131C、132N、133N、および133Cは、この特定のセットでは使用されていない。ポジティブコントロールは、細胞物質をバルクでペプチドに加工し、標識前に2〜5細胞/ μLのレベルに希釈することで構成されます。陰性対照は、単一細胞を添加することなく、単一細胞に使用されるすべての準備ステップによく供されるものからなる。略称: TMT = タンデム質量タグ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

SCoPE2による単一細胞の調製と分析を成功させるための鍵の1つは、キャリアとリファレンスチャネルの調製です。推奨されるキャリアサイズは100〜200セルです。しかしながら、特定の単一細胞実験に必要な細胞の数は、他の場所で論じられたような原理に基づいて決定することができる21。推奨サイズでは、384ウェルプレートあたり少なくとも~11,275細胞が必要であり、各セットで200セルのキャリアと5セルのリファレンスが可能です。所望の細胞集団が制限因子ではない場合、より多くの細胞を単離し、ミスの場合に単に余分な材料を有することが有利であり得る(このプロトコルで行われたように、11,275細胞の代わりに22,000細胞を単離する)。目的のプレート数に必要なキャリアとリファレンスの量は、バッチ間でペプチドの同定または定量が異なる原因となる可能性のあるバッチ間のばらつきを最小限に抑えるために、単一のバッチで調製する必要があります。

シングルセルを384ウェルプレートのウェルに単離する前に、プレートレイアウトの設計を考慮することが重要です。各384ウェルプレート内では、ポジティブコントロールとネガティブコントロールの両方を実装することをお勧めします。ネガティブコントロールは、細胞が添加されていないが、単一細胞ウェルと同じ試薬添加および手順を経るウェルです。ポジティブコントロールは、単一細胞の代わりに2〜5細胞/μLに希釈した細胞ライセートを添加したウェルです。これは、単一細胞単離法が十分に検証されていない場合に実装することが特に重要です。各384ウェルプレートは、理想的には単一細胞と対照のランダム化された分布を有するべきである(例えば、陰性または陽性の対照が1列だけにない)。各プレートは、1つのプレートで1つの細胞タイプを分離し、2番目のプレートで2番目の細胞タイプを分離するのではなく、関心のあるすべての細胞集団の均等な分布を持つ必要があります。これにより、バッチ効果と目的の細胞タイプが結び付けられるのを防ぐことができます。さらに、解析に複数の384ウェルプレートが必要な場合は、可能であれば、単離ステップを数日間に分散させるのではなく、1回のセッションで細胞を単離することをお勧めします。

単一細胞および担体/基準の両方の溶解は、凍結熱サイクル23を通じて水中で行われる。このステップでほとんどのプロテアーゼが変性することが予想されます。次いで、トリプシンは変性ステップの直後に高濃度で添加され、最も豊富な細胞プロテアーゼよりも何桁も高い濃度である。質量作用により、プロテアーゼ活性のほとんどの生成物はトリプシンによるものになります。

システイン残基の還元/アルキル化は、トリプシン消化の前にこのプロトコルでは行われません。システイン含有ペプチドは、ヒトプロテオーム由来のトリプシンペプチドの約10%を占めています。還元/アルキル化なしのアプローチを使用して、より少ないシステイン含有ペプチドを観察します。これらのステップでは、消化直後のTMT(NHSエステル化学)による標識に適合しない試薬を使用します。

このTMT標識戦略では、キャリアとリファレンスはそれぞれ126および127Nで標識され、シングルセルウェルとコントロールウェルは128Cから135Nで標識されます。参照後の2つの標識、127Cおよび128Nは、単一細胞よりもペプチド材料中に明らかにはるかに豊富である担体および参照チャネルから生じる同位体交差汚染のために使用されていない。TMTpro-16plexではシングルセルまたはコントロールウェルの標識に使用できるTMTチャンネルは合計12個、TMTpro-18plexではセットあたり14個のTMTチャンネルがあります。

このプロトコルを使用してシングルセルプロテオミクス測定を実行するためのプロトコルの重要なステップには、キャリアの調製、シングルセル単離、溶解、消化、バーコードラベリング、および適切な質量分析パラメーターが含まれます。これらの手順は、このドキュメントで概説されており、他の場所で広範囲に詳述されています17、21、25。各ステップには、DO-MSに対応するプロットまたはプロットのセットがあり、品質管理が容易です。例えば、担体の作成が成功した場合、同定されたペプチドの数、標識効率、およびミスカット率の割合を示すプロットにより、その成功した調製の検証が可能になります。代表的なDO−MSレポートは、この出版物に含まれており、元のデータ16について http://scope2.slavovlab.net/ で見ることができます。これらのDO-MSレポートは、より長いLC勾配、異なる消化酵素、代替化学バーコードなど、著者によってまだ調査されていない方向でのメソッドの最適化を評価することを可能にします。

現在、データ依存取得アルゴリズムによるペプチドの連続分析では、妥当な長さのLCランで分析できるペプチドの数が制限されています。これは、信頼性の高い単一細胞定量に十分なイオンを正常に取得するために必要な充填時間が長くなることに一部起因しています21。担体を使用することに固有の制限は、単一細胞の消化および標識効率の直接評価の欠如である。現在、この制限に対する1つの解決策は、単一細胞と一緒に処理されたより大きなサンプルに対して品質管理を実行することです。

私たちは、複数の分析装置を備えた質量分析計を構築するなど、シングルセルプロテオミクスを改善するための多くの機会を提案しました。現在の方法では、市販の試薬と装置を使用して、1日あたり約100細胞の速度で単一の哺乳類細胞から数千のタンパク質を定量することができます。SCoPE-MSアプローチの第2世代であるSCoPE2は、単位時間あたりに分析可能な細胞数、単位時間あたりに分析可能なタンパク質の数、サンプル調製に必要な時間、試薬と機器のアクセス可能性、および単一細胞あたりの調製と分析の全体的なコストに関して、前任者よりも大幅に改善されました。膜結合タンパク質は、尿素溶解と比較して示されているように、凍結熱溶解およびプロテアーゼ消化を使用してアクセス可能である23。この方法は、存在量16に関してプロテオームの上位3分の1から多くのタンパク質を同定する。修飾プロテオフォームがプロテオームの上部3分の1にあり、修飾ペプチドが質量分析に適している場合(イオン化がよく、非修飾ペプチドとは質量差がある)、このプロトコルに適している可能性が高くなります。この方法は、分化、老化、免疫学的応答(すなわち、食作用)など、細胞間に意味のある不均一性がある生物学的システムに実りあるものに適用できます。

開示事項

著者には利益相反はありません。

謝辞

この出版物に資金を提供してくれた2021年秋のNSF I-Corpsプログラム(ノースイースタン大学サイト)賞に感謝したいと思います。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
384-well plate, standard PCR plateThermo Fisher ScientificAB1384Polypropylene plates should be used, if need to substitute. If substituted, levels of potential polymer contamination from other plates should be assessed prior to SCoPE2 preparation.
Acetonitrile (for preparation of buffers), Optima LC-MS/MS gradeFisher ScientificA955-1This acetonitrile is used for any buffers, namely the 50% acetonitrile that is used to pass through wells after passing through the carrier and reference when combining SCoPE2 sets.
Caution: Acetonitrile is a flammable liquid. It can irritate skin, eyes, respiratory tract, and central nervous system. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood.
Acetonitrile (for preparation of TMT ), anhydrous, 99.8%Sigma Aldrich271004-100MLThis acetonitrile is used to resuspend TMT labels at the manufacturer concentration.
Caution: Acetonitrile is a flammable liquid. It can irritate skin, eyes, respiratory tract, and central nervous system. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood.
Adhesive PCR plate foilsThermo Fisher ScientificAB0626
Autosampler vial screw thread capsThermo Fisher ScientificC5000-51B
Autosampler vial spinner (i.e. myFuge 5)MTC BioC2595This model does not have any speed control. It is simply used to colelct liquid at the bottom of autosampler vials.
Benzonase nucleaseSigma AldrichE1014-25KU
Clear glass screw thread vials, 9 mmThermo Fisher Scientific60180-509
Formic Acid, Pierce, LC-MS/MS gradeThermo Fisher Scientific85178Caution: Formic acid is a flammable liquid. It can cause serious eye damage or skin burns. Be sure to wear personal protective equipment. Handle in a well-ventilated area.
Glass autosampler inserts, 9 mmThermo Fisher ScientificC4010-630
Hydroxylamine (HA), 50% wt/volSigma Aldrich467804-50MLCaution: Hydroxylamine can cause skin irritation. Be sure to wear personal protective equipment.
Mantis microfluidic chips, low-volume 3PFE chipsFormulatrixMCLVPR2These chips are meant to be used with the Mantis microfluidics liquid handler to dispense organic solutions. These can be used to dispense TMT labels.
Mantis microfluidic chips, low-volume silicone chipsFormulatrixMCLVS12These chips are meant to be used with the Mantis microfluidics liquid handler to dispense aqueous solutions. These cannot be used to dispense TMT labels.
Mantis microfluidic liquid handlerFormulatrixLiquid handler can be substituted. However, it is important to check if the system is compatible with 100% acetonitrile (as in the case of TMT labels), and that the system does not introduce polymer contamination or other type of contamination into the samples.
Mantis PCR plate adapter with wide conical pins for automated plate handlingFormulatrix232400
MassPREP peptide mixtureWaters186002337Mixture of nine nontryptic peptides
PCR tube spinner (i.e., 16-place microcentrifuge for 0.2 mL tubes)USA Scientific2621-0016This model does not have any speed control. It is simply used to collect liquid at the bottom of tubes.
PCR tubes: TempAssure 0.2 mL PCR 8-tube stripsUSA Scientific1402-3900If substituted, levels of potential polymer contamination from other plates should be assessed prior to SCoPE2 preparation.
Phosphate-buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4, RNase-freeThermo Fisher ScientificAM9625
Plate spinner (i.e., PlateFuge microcentrifuge)Benchmark ScientificModel C2000This model does not have any speed control. It is simply used to collect liquid at the bottom of wells.
Thermal Cycler (i.e., C1000 Touch with 384-well module)Biorad1851138
TMTpro 16plex Label Reagent Set, 1 x 5 mgThermo Fisher ScientificA44520
Triethylammonium bicarbonate (TEAB), 1 M, pH 8.5Sigma AldrichT7408100ML
Trypsin Gold Mass Spectrometry GradePromegaV5280This is trypsin is of very high purity. Other trypsin reagents can vary in their levels of purity. Level of purity is important for achieving positive SCoPE2 results.

Caution: Trypsin can cause skin, respiratory, and eye irritation. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood.
Vortex (Analog vortex mixer)VWRModel 58816-121
Water bath sonicator (i.e., 2.8 L ultrasonic cleaner with digital timer)VWR97043964
Water, Optima LC-MS/MS gradeFisher ScientificW6-1All solutions that need to be diluted or made are recommended to be made with mass-spectrometry grade water. Any dilutions and/or master mixes should be made fresh. Contamination resulting from lower-grade water can negatively affect peptide detection and single-cell data quality .

参考文献

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