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요약

이 프로토콜에서는 수동 및 자동 피펫팅 옵션과 함께 상용 시약 및 장비를 사용하여 질량분석 법을 통해 단일 세포 단백질체학 분석을 위해 포유류 세포를 준비하는 방법을 설명합니다.

초록

단일 세포 단백질체학 분석에는 민감하고 정량적으로 정확하며 널리 접근 가능하고 강력한 분석법이 필요합니다. 이러한 요구 사항을 충족하기 위해 단일 세포 단백질체학(SCoPE2) 프로토콜은 제한된 샘플에서 단일 세포 수준까지 수백에서 수천 개의 단백질을 정량화하는 2세대 방법으로 개발되었습니다. 이 방법을 사용한 실험은 질량 분석기 기기 시간 10 일 만에 1,500 개의 단일 포유류 세포 (세포 당 500-1,000 개의 단백질)에서 3,000 개 이상의 단백질을 정량화하는 데 성공했습니다. SCoPE2는 세포 용해를 위한 동결-열 주기를 활용하여 단일 세포를 세척할 필요가 없으며 결과적으로 시료 손실을 줄이는 동시에 시료 준비를 가속화하고 자동화를 단순화합니다. 또한이 방법은 단백질 식별을 돕고 샘플 손실을 줄이는 등압 캐리어를 사용합니다.

이 비디오 프로토콜은 널리 접근할 수 있는 장비와 시약만 사용하여 자동화된 단일 세포 단백질 분석을 채택할 수 있도록 자세한 지침을 제공합니다. 자사는 수확에서 주입, 액체 크로마토그래피-탠덤 질량분석법(LC-MS/MS) 분석에 이르기까지 단백질체학 분석을 위한 단일 세포 준비 절차의 중요한 단계를 보여줍니다. 또한 시청자는 등압 담체를 사용한 실험 설계의 원칙, 등압 담체 및 단일 세포 제제 모두에 대한 품질 관리, 접근 방식의 한계에 대한 논의와 함께 대표 결과를 안내합니다.

서문

단일 세포 분석은 대량 측정 1,2,3으로 식별 할 수없는 생물학적 시스템 내의 이질성 수준을 연구하는 데 널리 사용됩니다. 이러한 세포 다양성은 암세포 치료 내성 4,5,6에서 당뇨병 7,8,9,10의 세포 간 이질성에 이르기까지 완전한 생물학적 과정에 대한 이해를 증진시킬 수있는 기능적 결과를 가질 수 있습니다. 많은 연구가 유전 적 또는 전사체 수준을 측정하여 단일 세포의 핵산을 측정하는 데 초점을 맞추고 세포 유형 및 상태의 분류를 가능하게했습니다. 그러나, 핵산 공간에서의 이러한 진보는 전사 후 조절(11)의 지식 격차를 메울 수 없으며, 이는 단일 세포(12,13,14,15)에서 유사하게 고처리량 단백질 측정의 필요성을 야기한다.

당사는 포유류 시스템의 엄격하고 강력한 단일 세포 단백질체학에 대한 요구를 해결하기 위해 SCoPE216,17을 개발했습니다. 이는 멀티플렉스 방법으로, 시간19,20에서 하나의 셀을 분석하는 표지가 없는 mthod와 달리 병렬로 많은 세포를 라벨링하고 분석하여 처리량을 증가시킬 수 있습니다. 샘플 준비 방법론, 질량 분석 접근법 및 후속 데이터 분석 단계를 통해 단일 세포당 수백에서 수천 개의 단백질을 정확하게 정량화할 수 있습니다. 이 방법은 관심있는 단일 세포 집단과 생물학적으로 유사한 세포의 작은 벌크 샘플 (일반적으로 25-200)인 등압 담체(21)를 통해 단일 세포의 질량 분석법을 가능하게합니다. 이 캐리어 재료는 탠덤 질량 태그 (TMT 라벨)를 사용하여 동일한 재료 및 단일 셀의 기준 채널이있는 세트로 다중화됩니다. 캐리어 채널은 표면적에 대한 샘플 손실을 줄이고 성공적인 펩타이드 식별을 위한 이온 백본 단편을 제공합니다. 벌크로 준비된 후 각 단일 셀 세트에 대해 5-10 셀 당량으로 희석되는 기준 채널은 분석의 기술적 변동성을 제어하는 데 도움이 됩니다. 특히, 이 기준은 이온 샘플링 및 이온화 효율과 같은 LC-MS/MS 관련 효과로 인한 변동성의 정규화를 허용합니다. 보통, 기준 및 캐리어 채널은 동일한 세포 집단으로부터 이루어진다.

이 샘플 준비 프로토콜은 SCoPE-MS22를 기반으로 여러 시너지 개선을 통해 구축된 2세대 분석법입니다. 개선 사항에는 MS 단백질체학 제제의 일반적인 단계인 샘플 세척을 피하는 세포 용해 방법이 포함됩니다. 동결 열 용해 방법인 mPOP(최소 단백질체 시료 준비)23을 사용합니다. 이 방법은 바이알이 아닌 더 작은 부피와 멀티웰 플레이트에서 단일 세포의 용해를 가능하게 하여 열 순환기에 의한 더 높은 처리 속도와 자동화를 촉진했습니다. 전체적으로 이 방법은 SCoPE-MS16,24에 비해 단일 셀당 비용을 낮추고 정량적 정확도를 높였습니다.

이 프로토콜은 TMTpro 18-plex 등압 라벨을 사용하여 캐리어 및 기준 채널을 준비하는 방법을 포함하여 단백질체 분석을 위해 단일 세포를 준비하는 방법을 설명합니다. 단일 세포 현탁액에 있고 384-웰 플레이트로 분리될 수 있는 포유류 세포는 이 프로토콜에 적합할 가능성이 높습니다. 또한 R Shiny 앱인 DO-MS25에서 생성된 여러 품질 관리 플롯을 표시하는 성공적인 단일 셀 세트의 대표적인 결과가 포함되어 있습니다. 다른 공개된 소프트웨어 도구(26,27) 및 실험 지침(17,21)은 이 프로토콜의 채택을 개선하였다. 이 시각적 가이드가 연구자들이 단일 세포 단백질체학 실험을 수행하는 데 도움이 되기를 바랍니다.

프로토콜

알림: 이 프로토콜에서 실온(RT)은 18-22°C입니다.

1. 캐리어 및 참조 물질 생성

  1. 세포 분리
    1. 관심 세포를 얼음처럼 차가운 1x PBS의 세포 현탁액으로 수집합니다.
      참고: 가능하면 담체 및 참조 물질은 단일 세포 수준에서 연구하도록 선택된 세포 집단에서 준비해야 합니다. 상이한 실험 조건으로부터의 유사한 수의 세포(예: 자극된 면역 세포 및 자극되지 않은 면역 세포)가 담체 및 기준을 구성해야 한다. 충분히 많은 수의 이들 세포를 수확할 수 없는 상황에서, 생물학적 유사성에 기초하여 적합한 세포 집단이 선택되어야 한다.
    2. 혈구계 또는 다른 세포 계수 수단(예: FACS)을 사용하여 현탁액의 세포 수를 계산합니다.
    3. 각 세포 유형의 세포 22,000개 세포를 11μL의 HPLC 등급 물에 스핀다운하고 재현탁하여 PCR 튜브(표준 250μL PCR 튜브)에 별도로 재현탁합니다.
      참고: 여기에 표시된 셀 수는 단일 셀로 가득 찬 384웰 플레이트에서 준비할 수 있는 세트 수에 대한 캐리어 및 참조에 충분합니다. 이 단계의 셀 입력과 후속 단계의 시약 양은 더 많은 수의 세트에 대해 비례적으로 스케일링될 수 있습니다. 스핀 다운 속도는 실험실의 세포 배양 관행에 따라 다릅니다. 일반적인 스핀 다운 : 5 분 동안 300 × g .
    4. 샘플을 -80°C 냉동고로 최소 30분 동안 옮깁니다.
      일시 중지 지점: 샘플은 단일 셀 데이터에 영향을 미치지 않고 몇 개월 동안 동결된 상태로 유지될 수 있습니다.
  2. 세포 용해
    1. 세포가 있는 PCR 튜브를 90°C로 10분 동안 가열하고(열 순환기 뚜껑을 105°C로 설정한 상태에서) 가열 주기 직후 튜브를 12°C로 식힙니다.
    2. 튜브를 짧게 소용돌이 한 다음 RT의 벤치 탑 PCR 튜브 스피너에서 스핀 다운하여 튜브 바닥에있는 모든 액체를 수집합니다.
    3. 수조 초음파 처리기에서 튜브를 5분 동안 초음파 처리한 다음 RT에서 얼음 위에 놓습니다.
  3. 트립신 소화
    1. 얼음 위에 있는 동안 각 샘플 튜브에 2.2μL의 마스터 믹스(구성 요소는 표 1 참조)를 추가합니다.
      주의: 트립신은 피부, 호흡기 및 눈 자극을 유발할 수 있습니다. 개인 보호 장비를 착용하십시오. 화학 흄 후드 아래에서 다루십시오.
    2. 튜브를 잠시 소용돌이하여 RT의 벤치탑 PCR 튜브 스피너에서 혼합 및 스핀다운하여 각 튜브의 바닥에 있는 모든 액체를 수집합니다.
    3. 샘플을 37°C에서 3시간 동안 가열합니다(열 순환기 뚜껑을 52°C로 설정한 상태).
  4. TMT 표지 반응
    1. RT에서 벤치탑 PCR 튜브 스피너에서 분해 후 샘플을 스핀다운합니다.
    2. 각 샘플을 각각 6.6μL의 동일한 부피 2개로 분할하여 각 튜브에 11,000개의 세포가 포함되도록 합니다.
    3. 담체용 튜브에 85mM 농도로 재현탁된 TMT 라벨 126 3.3μL를 추가합니다.
    4. 참조용 튜브에 85mM 농도로 재현탁된 TMT 라벨 127N 3.3μL를 추가합니다.
    5. 튜브를 잠시 소용돌이치고 RT의 벤치탑 PCR 튜브 스피너에서 스핀다운하여 바닥에 액체를 수집합니다.
    6. 튜브를 RT에서 1시간 동안 그대로 두십시오.
  5. TMT 표지 반응의 퀀칭
    1. 각 튜브에 1.65 μL의 0.5 % 하이드 록실 아민을 첨가하십시오.
      주의: 하이드록실아민은 피부 자극을 유발할 수 있습니다. 개인 보호 장비를 착용하십시오.
    2. 튜브를 잠시 소용돌이치고 RT의 벤치탑 PCR 튜브 스피너에서 스핀다운하여 바닥에 액체를 수집합니다.
    3. 튜브를 RT에서 30분 동안 그대로 두십시오.
  6. 캐리어와 레퍼런스의 조합
    1. 캐리어를 구성 할 샘플이 별도로 라벨링 된 경우 동일한 비율로 혼합하십시오.
    2. 참조를 구성할 샘플에 별도로 라벨이 부착된 경우 동일한 비율로 혼합하십시오.
    3. 담체의 최종 농도가 100-200 cells/μL이고 기준 농도가 5-10 cells/μL가 되도록 캐리어와 기준을 혼합합니다.
    4. 캐리어 및 참조 물질을 단일 셀 세트와 결합하기 전에 품질을 평가합니다.
      알림: 캐리어 및 참조 물질의 품질 관리는 다양한 방법으로 수행할 수 있지만 do-ms.slavovlab.net17에서 제공되는 DO-MS 소프트웨어를 사용하는 것이 좋습니다. 품질의 중요한 측정에는 절단율(<25%, 절단이 누락된 확신 있게 식별된 펩타이드의 수를 총 확실하게 식별된 펩타이드 수로 나눈 값으로 계산된 메트릭) 및 라벨링 효율성(>99%, 라벨링 부위, 즉 펩타이드 N-말단 및 라이신의 수로 계산된 메트릭, 라벨을 총 라벨링 부위 수로 나눈 값)이 포함됩니다.
      일시 중지 지점: 캐리어 및 참조 물질은 필요할 때까지 -80°C에서 보관할 수 있습니다.
구성 요소혼합 농도튜브당 최종 농도
트립신 골드50 나노/μL8.33 NG/μL
티브, pH = 8.5500 밀리미터83.33 밀리미터
벤조나아제 뉴클레아제1.2 단위0.2 단위

표 1: 마스터 믹스의 시약량. 트립신 소화에 필요한 시약의 최종 농도가 나열되어 있습니다.

2. SCoPE2 샘플 준비

  1. 세포 분리
    1. 합성 펩타이드 용액의 μL 당 펩타이드 당 25 fmol로 HPLC 등급 물을 보충하십시오.
      참고: Waters MassPrep 펩타이드 용액은 사용할 수 있는 것의 예입니다. 이온화되지 않는 7 개의 펩타이드로 구성되어 있습니다. 이것이 이 솔루션의 핵심 측면입니다: 이 펩타이드는 단일 세포의 정확한 질량 분석 정량을 방해하지 않습니다. 관심있는 샘플에 없을 것 같은 몇 가지 펩티드의 고도로 정제 된 혼합물이 적절할 것입니다.
    2. 이 혼합물 1μL를 액체 분주 로봇 또는 수동 피펫을 사용하여 384웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다.
    3. 플레이트를 밀봉하고 RT의 벤치 탑 플레이트 스피너에서 회전시켜 바닥에 액체를 수집합니다.
      일시 중지 지점: 이 용액이 포함된 플레이트는 필요할 때까지 -80°C에서 보관할 수 있습니다.
    4. 분해된 고정되지 않은 세포의 현탁액을 얻습니다.
      참고: 세포 현탁액을 정확히 얻는 방법은 관심 세포 유형에 따라 다릅니다. 다음은 광범위한 예입니다.
      1. 현탁 세포: 세포를 펠릿으로 스핀다운하고, 세포 배양 배지를 제거한다.
      2. 부착 세포: 트립신 화 또는 긁기를 통해 접시 또는 플라스크에서 세포를 제거합니다. 그런 다음 스핀 다운하여 세포 배양 배지를 제거합니다.
    5. 세포 현탁액을 1x 얼음처럼 차가운 PBS로 두 번 세척합니다. 세포를 2차 세척 후 1x PBS에 현탁시킨 채로 둔다.
    6. 384웰 플레이트가 얼었다면 RT에서 해동합니다. 모든 액체가 웰 바닥에 있는지 확인하기 위해 아래로 돌리십시오.
    7. 세포 분류기 또는 수동 핸드피킹과 같은 기타 사용 가능한 수단을 사용하여 단일 세포를 각 웰에 분배합니다.
      알림: 웰에 단일 세포를 추가하고 일부 웰은 음성 및 양성 대조군을 위해 비워 둡니다(토론 참조). 유세포분석을 사용하는 경우 유세포분석기에 가능한 가장 낮은 유속을 사용하십시오. 낮은 유속은 세포 취급에 더 부드러운 것으로 생각됩니다. 또한 노즐 크기는 관심 셀과 함께 사용하기에 적합해야 합니다. 유세포 분석 시설과 협력하는 것이 좋습니다.
    8. 2-5 세포 당량 용해물의 양성 대조군을 수동으로 또는 액체 취급 로봇으로 피펫팅된 선택된 웰에 추가합니다.
    9. RT의 벤치 탑 플레이트 스피너에서 분류 된 셀로 플레이트를 밀봉하고 스핀 다운하여 바닥에 액체를 수집합니다. 가능한 한 빨리 플레이트를 -80 ° C에서 동결하십시오.
      일시 중지 지점: 정렬된 단일 셀이 있는 플레이트는 필요할 때까지 -80°C에서 보관할 수 있습니다.
  2. 세포 용해
    1. 분류된 단일 셀이 있는 384웰 플레이트를 가능한 한 빨리 열 순환기에 넣습니다.
    2. 플레이트를 90 ° C로 10 분 동안 가열 한 다음 (뚜껑 온도를 105 ° C로 설정 한 상태) 플레이트를 12 ° C로 식히십시오.
    3. RT의 벤치 탑 플레이트 스피너에서 플레이트를 잠깐 회전시킵니다.
    4. 수조 초음파 처리기에서 RT에서 5 분 동안 플레이트를 초음파 처리 한 다음 얼음 위에 놓습니다.
  3. 트립신 소화
    1. 100웰 플레이트당 100μL의 마스터 믹스(구성 요소는 표 384 참조)를 준비합니다.
    2. 384-웰 플레이트의 각 웰에, 액체 핸들러를 사용하여 단계 2.3.1에서 제조된 마스터 믹스 0.2 μL를 첨가한다.
      참고: 수동 피펫팅을 사용하는 경우 더 많은 양을 사용하여 시약의 최종 농도가 웰당 동일한지 확인하십시오.
    3. 플레이트를 밀봉하고 5초 동안 소용돌이한 다음 RT에서 벤치탑 플레이트 스피너에서 회전합니다.
    4. 384웰 플레이트를 37°C(뚜껑 온도를 52°C로 설정)에서 3시간 동안 가열합니다.
  4. TMT 표지 반응
    1. -80°C 냉동고에서 TMT 라벨(128N - 135N)의 85mM 재고를 꺼냅니다. 튜브를 열기 전에 실온으로 데우십시오.
    2. 라벨을 무수 아세토니트릴에서 22 mM로 희석한다.
      주의 : 아세토 니트릴은 가연성 액체입니다. 피부, 눈, 호흡기 및 중추 신경계를 자극 할 수 있습니다. 개인 보호 장비를 착용하십시오. 화학 흄 후드 아래에서 다루십시오.
    3. 이 라벨링 전략을 사용하여 0.5μL의 희석된 TMT 라벨을 384웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 액체 분주 로봇(액체 처리기를 사용하는 경우 유기 용제에 적합한 관련 장비를 사용해야 함) 또는 수동 피펫을 사용하십시오.
      참고: 라벨링 전략에 대해서는 표 2 를 참조하십시오. 예제 플레이트 레이아웃은 표 3 을 참조하십시오.
    4. 플레이트를 밀봉하고 5초 동안 소용돌이한 다음 RT에서 벤치탑 플레이트 스피너에서 회전합니다.
    5. 라벨링 반응이 RT에서 1시간 동안 진행되도록 합니다.
  5. TMT 표지 반응의 퀀칭
    1. 384웰 플레이트의 각 웰에 액체 처리기를 사용하여 0.5% 하이드록실아민(HPLC 등급 물에 희석) 0.2μL를 추가합니다.
      참고: 수동 피펫팅을 사용하는 경우 더 많은 양을 사용하여 시약의 최종 농도가 웰당 동일한지 확인하십시오.
    2. 플레이트를 밀봉하고 5초 동안 소용돌이한 다음 RT에서 벤치탑 플레이트 스피너에서 회전합니다.
    3. 플레이트를 RT에서 30분 동안 유지하십시오.
  6. LC-MS/MS 분석 준비: 단일 세포 및 대조군 웰과 캐리어/참조 물질의 조합
    1. 결합된 캐리어/표준 물질을 -80°C 냉동고에서 제거합니다.
    2. 각 세트에 대해, 1 μL의 담체 및 기준 물질을 단일 세트의 일부가 될 첫 번째 웰에 피펫팅한다. 첫 번째 웰의 전체 부피를 후속 웰로 피펫팅합니다. 단일 세트에 포함될 모든 웰이 최종 웰에 결합될 때까지 한 셀에서 다음 셀로 전체 부피를 계속 피펫팅합니다.
      참고: 담체 및 기준 물질은 각각 200- 및 5-셀 등가물의 농도여야 하지만, 앞서 논의된 바와 같이21-양은 다를 수 있다. 라벨링 전략( 표 2 참조)에 설명된 바와 같이 각 세트는 TMTpro-16plex 또는 TMTpro-18plex를 사용할 때 캐리어, 참조 및 최대 12개 또는 14개의 단일 셀 또는 대조군 샘플을 각각 포함해야 합니다(단계 2.4.3 참조).
    3. 각 세트에 대해 5μL의 50% 아세토니트릴(HPLC 등급 물에 희석)을 각 세트에 포함할 첫 번째 단일 셀 웰에 추가합니다. 첫 번째 우물에서 후속 우물까지 전체 볼륨을 피펫하십시오. 단일 세트에 포함될 모든 웰이 최종 웰에 결합될 때까지 한 셀에서 다음 셀로 전체 부피를 계속 피펫팅합니다.
      알림: 이 세척 단계는 웰에서 샘플을 회수하는 데 도움이 될 수 있습니다.
    4. 각 세트를 개별 오토샘플러 유리 인서트로 옮깁니다.
      참고: 이러한 세트는 또한 384-웰 플레이트의 단일 웰로 결합될 수 있고 주입(28)을 위해 오토샘플러에 직접 배치될 수 있다.
    5. 모든 세트를 결합하여 유리 삽입물에 넣으면 샘플을 건조시킵니다.
      일시 중지 지점: 건조된 세트는 질량분석기에서 실행하기 전에 최소 1주일 동안 -80°C에서 보관할 수 있습니다.
    6. LC-MS/MS 분석 전에 1.2μL의 0.1% 포름산(HPLC 등급 물에 희석)을 각 세트에 추가하여 표지된 펩타이드를 재현탁시킵니다.
      주의 : 포름산은 가연성 액체입니다. 심각한 눈 손상이나 피부 화상을 유발할 수 있습니다. 개인 보호 장비를 착용하십시오. 환기가 잘되는 곳에서 다루십시오.
    7. 자동 시료 주입기 삽입물을 유리 자동 시료 주입기 바이알에 넣고 각 시료를 캡으로 닫습니다.
    8. 각 바이알을 5초 동안 소용돌이하여 재현탁이 완료되었는지 확인한 다음 RT의 바이알 스피너에서 스핀다운합니다.
    9. 각 샘플이 측면에 튀지 않고 인서트의 바닥에 있는지 확인하십시오.
    10. 바이알을 자동 시료 주입기 트레이에 넣습니다.
    11. 각 세트에 대해 LC-MS/MS 분석을 위해 1μL를 주입합니다.
레이블126127N127씨128N128씨129N129씨130N130씨....135N
샘플 유형항공모함참조비우다비우다SC/컨트롤SC/컨트롤SC/컨트롤SC/컨트롤SC/컨트롤....SC/컨트롤

표 2: SCoPE2 TMTpro-18plex 라벨링 방식의 예. 캐리어와 레퍼런스는 일반적으로 처음 두 개의 TMT 라벨에 라벨링된다. 그런 다음 다음 두 라벨은 정량 분석의 정확도를 떨어뜨릴 수 있는 잠재적인 동위원소 오염으로 인해 건너뜁니다. 나머지 레이블은 단일 셀 또는 컨트롤에 대한 것입니다.

128씨129N129씨130N130씨131N131C132N132C133N133씨134N128씨129N129씨130N130씨131N131C132N132C133N133씨134N
123456789101112131415161718192021222324
A사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나-사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나+사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나-사우스 캐롤라이나+사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나
B사우스 캐롤라이나+사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나+사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나-사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나+
C사우스 캐롤라이나-사우스 캐롤라이나-사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나+사우스 캐롤라이나-사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나+사우스 캐롤라이나-사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나-
D사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나-사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나+사우스 캐롤라이나-사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나
E사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나+사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나-사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나
F사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나-사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나+사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나+사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나+사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나
G사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나+사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나-사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나
H사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나+사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나+사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나
나는사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나+사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나-사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나사우스 캐롤라이나
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표 3: TMTpro-16plex를 사용한 라벨링을 위한 플레이트 레이아웃의 예. 384웰 플레이트 형식(또는 다른 플레이트 형식)을 사용하여 세포가 정렬되는 웰을 무작위화하는 것이 중요합니다. TMTpro-18plex에는 다른 플레이트 레이아웃이 사용됩니다.

결과

프로토콜의 긍정적인 결과는 프로토콜의 여러 중요한 단계가 성공적으로 수행되었는지 확인하는 것을 수반합니다. 여기에는 캐리어 준비, 단일 세포 분리, 용해, 분해, 바코드 라벨링 및 MS 파라미터 최적화가 포함됩니다. DO-MS 플롯을 사용하면 프로토콜의 각 중요 단계 완료를 쉽게 평가할 수 있습니다. 일반적으로 25 및 200 셀의 양 (세트당)에 해당하는 성공적으로 준비된 담체는 잘 소화되고 잘 표지됩니다. DO-MS의 플롯을 통해 샘플의 강도(수량 추정), 분해 효율(이상적으로는 <25% 이질) 및 라벨링 효율(>99%여야 함)을 정량화할 수 있습니다. 가장 중요한 것은 완전히 표지되지 않은 담체 샘플이 단일 세포용 바코드와의 교차 반응을 허용하고 단일 세포 펩타이드의 정량화에 가짜 신호를 추가할 수 있다는 것입니다.

음성 대조군 웰에는 모든 실험 시약이 포함되지만 세포가 없습니다. 이를 통해 배경 잡음을 평가할 수 있을 뿐만 아니라 빈 우물의 대표적인 신호를 제공하여 세포 분리 효율을 결정할 수 있습니다. DO-MS 보고서는 세포 분리 및 배경 잡음의 성공을 결정하기 위해 단일 셀 웰과 함께 제어 웰의 측정된 신호를 평가하는 플롯을 제공합니다. 추가적으로, 정량의 품질은 SCoPE2 파이프라인(GitHub: github.com/SlavovLab/SCoPE2 에서 이용 가능) 또는 SCP 바이오컨덕터 패키지29를 사용하여 평가할 수 있다.

단일 세포의 소화 및 표지 효율은 담체와 같이 직접 분석되지 않을 수 있지만, DO-MS는 다시 소화 및 표지 효율의 추정을 허용하는 플롯을 제공한다. 단일 세포의 준비와 함께 100-200 세포의 대조군을 포함함으로써(즉, 모든 동일한 시약 첨가를 받음), 해당 대조군에 대한 소화 및 라벨링 효율을 평가할 수 있으며, 함께 준비된 단일 세포에 의해 공유되는 것으로 가정할 수 있습니다. 불량한 소화는 완전히 절단된 펩타이드에 대한 잘못 절단된 펩타이드의 강도의 높은 비율로 나타납니다(그림 1).

세트에서 고려해야 할 또 다른 요소는 누락된 데이터의 비율과 각 TMT 채널의 리포터 이온 강도 중앙값입니다(그림 2). 단일 세포가 성공적으로 준비되면 세포 및 양성 대조군당 누락된 데이터의 양은 음성 대조군 샘플보다 훨씬 적습니다. 마찬가지로, 전구체의 중간 강도는 음성 대조군보다 단일 세포 및 양성 대조군에서 훨씬 더 높습니다. MS 파라미터의 최적화는 다른 곳(21)에서 광범위하게 논의되었으며, 최적 파라미터는 DO-MS 또는 SCP 컴패니언25, 27과 같은 툴을 사용하여 결정될 수 있다.

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그림 1: 캐리어 준비 품질 관리. DO-MS 플롯은 (A) TMT로 표지하는 부위에서 성공적으로 준비된 담체의 표지 효율: 라이신의 측쇄 및 펩티드 N-말단의 1차 아민, 및 (B) 트립신 절단의 아미노산 잔기에서의 소화 효율을 묘사합니다. 약어 : TMT = 탠덤 질량 태그. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 단일 세포 준비 품질 관리. DO-MS는 (A) 단일 세포(C5-10), 대조군(C13,16), 캐리어(C1) 및 기준(C2)에서 누락된 데이터의 비율과 (B) 단일 세포 및 대조군의 강도를 보여줍니다. C3, C4, C11, C12 및 C15에 대응하는 태그(127C, 128N, 131C, 132N, 133N, 및 133C)는 이 특정 세트에서 사용되지 않는다. 양성 대조군은 펩타이드로 대량으로 처리 된 세포 물질로 구성되며, 라벨링 전에 2-5 cells / μL 수준으로 희석됩니다. 음성 대조군은 단일 세포를 추가하지 않고 단일 세포에 사용되는 모든 준비 단계를 잘 실시하는 것으로 구성됩니다. 약어 : TMT = 탠덤 질량 태그. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

SCoPE2에 의한 단일 세포의 성공적인 준비 및 분석의 열쇠 중 하나는 캐리어 및 기준 채널의 준비입니다. 제안된 담체 크기는 100 내지 200 셀이고; 그러나, 특정 단일-세포 실험에 필요한 세포의 수는 다른 곳에서 논의된 바와 같은 원리들에 기초하여 결정될 수 있다(21). 제안된 크기의 경우 384웰 플레이트당 최소 ~11,275개의 셀이 필요하므로 각 세트에서 200셀 캐리어 및 5셀 참조가 가능합니다. 원하는 세포 집단이 제한 요소가 아닌 경우 더 많은 세포를 분리하고 실수의 경우 단순히 추가 물질을 갖는 것이 유리할 수 있습니다(이 프로토콜에서 수행된 것처럼 11,275개 세포 대신 22,000개 세포 분리). 원하는 플레이트의 수에 필요한 캐리어 및 기준의 양은 펩타이드 식별 또는 정량화가 배치 간에 다를 수 있는 배치 간 변동을 최소화하기 위해 단일 배치로 준비되어야 합니다.

단일 셀을 384웰 플레이트의 웰로 분리하기 전에 플레이트 레이아웃의 설계를 고려하는 것이 중요합니다. 각 384웰 플레이트 내에서 양성 및 음성 대조군을 모두 구현하는 것이 좋습니다. 음성 대조군은 세포가 추가되지 않았지만 단일 세포 웰과 동일한 시약 추가 및 절차를 거치는 웰입니다. 양성 대조군은 단일 세포 대신 2-5 cells/μL로 희석된 세포 용해물이 첨가된 웰입니다. 이는 단일 셀 격리 방법이 잘 검증되지 않은 경우 구현하는 데 특히 중요합니다. 각각의 384-웰 플레이트는 이상적으로 단일 세포 및 대조군의 무작위 분포를 가져야 한다(예를 들어, 단지 한 행에 음성 또는 양성 대조군이 없음). 각 플레이트는 한 플레이트에서 하나의 세포 유형을 분리하고 두 번째 플레이트에서 두 번째 세포 유형을 분리하는 대신 관심 있는 모든 세포 집단의 균등한 분포를 가져야 합니다. 이렇게 하면 배치 효과를 관심 있는 셀 유형과 연결하는 것을 방지할 수 있습니다. 또한 분석을 위해 하나 이상의 384웰 플레이트가 필요한 경우 가능하면 분리 단계를 며칠에 걸쳐 분산하는 대신 단일 세션에서 세포를 분리하는 것이 좋습니다.

단일 세포 및 담체/기준 모두의 용해는 동결-열 사이클(23)을 통해 물에서 일어난다. 대부분의 프로테아제는 이 단계 동안 변성될 것으로 예상됩니다. 그런 다음 트립신은 변성 단계 직후에 고농도로 첨가되며, 이는 가장 풍부한 세포 프로테아제보다 훨씬 더 높은 농도입니다. 대량 작용에 의해, 프로테아제 활성의 대부분의 생성물은 트립신 때문일 것이다.

시스테인 잔기의 환원/알킬화는 트립신 소화 전에 이 프로토콜에서 수행되지 않습니다. 시스테인 함유 펩타이드는 인간 프로테옴에서 트립신 펩타이드의 약 10%를 차지합니다. 우리는 환원/알킬화가 없는 접근법을 사용하여 더 적은 수의 시스테인 함유 펩타이드를 관찰합니다. 이 단계는 소화 직후 TMT(NHS-에스테르 화학)에 의한 라벨링과 호환되지 않는 시약을 사용합니다.

이 TMT 라벨링 전략에서, 담체 및 참조는 각각 126 및 127N으로 표지되는 반면, 단일 셀 및 대조군 웰은 128C 내지 135N으로 표지된다. 기준 뒤의 두 라벨인 127C 및 128N은 단일 세포보다 펩타이드 물질이 훨씬 더 풍부한 캐리어 및 기준 채널에서 발생하는 동위원소 교차 오염으로 인해 사용되지 않습니다. 총 세트당 12개의 TMT 채널이 있어 TMTpro-16plex로 단일 셀 또는 제어 웰을 라벨링하는 데 사용할 수 있으며, TMTpro-18plex를 사용하여 세트당 14개의 TMT 채널이 있습니다.

이 프로토콜을 사용하여 단일 세포 단백질체학 측정을 수행하기 위한 프로토콜의 중요한 단계에는 캐리어 준비, 단일 세포 분리, 용해, 분해, 바코드 라벨링 및 적절한 질량 분석 파라미터가 포함됩니다. 이러한 단계는 이 문서에 요약되어 있으며 17,21,25의 다른 곳에서 광범위하게 자세히 설명되어 있습니다. 각 단계에는 DO-MS에 해당하는 플롯 또는 플롯 세트가 있어 품질 관리가 용이합니다. 예를 들어, 담체의 성공적인 생성의 경우, 확인된 펩티드의 수, 표지 효율 및 절단 속도의 백분율을 나타내는 플롯은 그의 성공적인 제제의 검증을 허용한다. 대표적인 DO-MS 보고가 이 간행물에 포함되어 있고, 원본 데이터(16)에 대해 http://scope2.slavovlab.net/ 에서 볼 수 있다. 이러한 DO-MS 보고서를 통해 더 긴 LC 구배, 다른 소화 효소 또는 대체 화학 바코드와 같이 저자가 아직 조사하지 않은 방향으로 방법의 최적화를 평가할 수 있습니다.

현재, 데이터 의존적 획득 알고리즘에 의한 펩타이드의 연속 분석은 합리적인 길이의 LC 실행에서 분석할 수 있는 펩타이드의 수를 제한합니다. 이는 부분적으로 신뢰할 수 있는 단일 세포 정량화를 위한 충분한 이온의 성공적인 획득에 필요한 더 긴 충전 시간 때문입니다21. 담체 사용에 대한 본질적인 한계는 단일 세포의 소화 및 표지 효율에 대한 직접적인 평가가 부족하다는 것이다. 현재 이러한 제한에 대한 한 가지 해결책은 단일 세포와 함께 처리된 더 큰 샘플에 대해 품질 관리를 수행하는 것입니다.

우리는 여러 분석기로 질량분석기를 구축하는 것과 같이 단일 세포 단백질체학을 개선할 수 있는 여러 기회를 제안했습니다. 현재의 방법은 상업적으로 이용 가능한 시약 및 장비를 사용하여 하루에 약 100 세포의 속도로 단일 포유류 세포에서 수천 개의 단백질을 정량화 할 수 있습니다. SCoPE-MS 접근법의 2세대인 SCoPE2는 단위 시간당 분석 가능한 세포 수, 단위 시간당 분석 가능한 단백질 수, 샘플 준비에 필요한 시간, 시약 및 장비의 접근성, 단일 세포당 전체 준비 및 분석 비용 측면에서 이전 제품에 비해 크게 개선되었습니다. 막-결합된 단백질은 우레아 용해23과 비교하여 나타낸 바와 같이 동결열 용해 및 프로테아제 소화를 사용하여 접근가능하다. 상기 방법은 풍부도16과 관련하여 프로테옴의 상위 1/3로부터 많은 단백질을 확인한다. 변형된 단백질형이 프로테옴의 상위 3분의 1에 있고 변형된 펩타이드가 질량 분석 가능하면(이온화는 양호하고 변형되지 않은 펩타이드와 질량 차이가 있음) 이 프로토콜에 복종할 가능성이 더 높습니다. 이 방법은 분화, 노화 또는 면역 학적 반응 (즉, 식균 작용)과 같이 세포간에 의미있는 이질성이있는 생물학적 시스템에 유익하게 적용될 수 있습니다.

공개

저자는 이해 상충이 없습니다.

감사의 말

이 출판물에 자금을 지원한 2021년 가을 NSF I-Corps 프로그램(노스이스턴 대학교 사이트) 상을 인정하고 싶습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
384-well plate, standard PCR plateThermo Fisher ScientificAB1384Polypropylene plates should be used, if need to substitute. If substituted, levels of potential polymer contamination from other plates should be assessed prior to SCoPE2 preparation.
Acetonitrile (for preparation of buffers), Optima LC-MS/MS gradeFisher ScientificA955-1This acetonitrile is used for any buffers, namely the 50% acetonitrile that is used to pass through wells after passing through the carrier and reference when combining SCoPE2 sets.
Caution: Acetonitrile is a flammable liquid. It can irritate skin, eyes, respiratory tract, and central nervous system. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood.
Acetonitrile (for preparation of TMT ), anhydrous, 99.8%Sigma Aldrich271004-100MLThis acetonitrile is used to resuspend TMT labels at the manufacturer concentration.
Caution: Acetonitrile is a flammable liquid. It can irritate skin, eyes, respiratory tract, and central nervous system. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood.
Adhesive PCR plate foilsThermo Fisher ScientificAB0626
Autosampler vial screw thread capsThermo Fisher ScientificC5000-51B
Autosampler vial spinner (i.e. myFuge 5)MTC BioC2595This model does not have any speed control. It is simply used to colelct liquid at the bottom of autosampler vials.
Benzonase nucleaseSigma AldrichE1014-25KU
Clear glass screw thread vials, 9 mmThermo Fisher Scientific60180-509
Formic Acid, Pierce, LC-MS/MS gradeThermo Fisher Scientific85178Caution: Formic acid is a flammable liquid. It can cause serious eye damage or skin burns. Be sure to wear personal protective equipment. Handle in a well-ventilated area.
Glass autosampler inserts, 9 mmThermo Fisher ScientificC4010-630
Hydroxylamine (HA), 50% wt/volSigma Aldrich467804-50MLCaution: Hydroxylamine can cause skin irritation. Be sure to wear personal protective equipment.
Mantis microfluidic chips, low-volume 3PFE chipsFormulatrixMCLVPR2These chips are meant to be used with the Mantis microfluidics liquid handler to dispense organic solutions. These can be used to dispense TMT labels.
Mantis microfluidic chips, low-volume silicone chipsFormulatrixMCLVS12These chips are meant to be used with the Mantis microfluidics liquid handler to dispense aqueous solutions. These cannot be used to dispense TMT labels.
Mantis microfluidic liquid handlerFormulatrixLiquid handler can be substituted. However, it is important to check if the system is compatible with 100% acetonitrile (as in the case of TMT labels), and that the system does not introduce polymer contamination or other type of contamination into the samples.
Mantis PCR plate adapter with wide conical pins for automated plate handlingFormulatrix232400
MassPREP peptide mixtureWaters186002337Mixture of nine nontryptic peptides
PCR tube spinner (i.e., 16-place microcentrifuge for 0.2 mL tubes)USA Scientific2621-0016This model does not have any speed control. It is simply used to collect liquid at the bottom of tubes.
PCR tubes: TempAssure 0.2 mL PCR 8-tube stripsUSA Scientific1402-3900If substituted, levels of potential polymer contamination from other plates should be assessed prior to SCoPE2 preparation.
Phosphate-buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4, RNase-freeThermo Fisher ScientificAM9625
Plate spinner (i.e., PlateFuge microcentrifuge)Benchmark ScientificModel C2000This model does not have any speed control. It is simply used to collect liquid at the bottom of wells.
Thermal Cycler (i.e., C1000 Touch with 384-well module)Biorad1851138
TMTpro 16plex Label Reagent Set, 1 x 5 mgThermo Fisher ScientificA44520
Triethylammonium bicarbonate (TEAB), 1 M, pH 8.5Sigma AldrichT7408100ML
Trypsin Gold Mass Spectrometry GradePromegaV5280This is trypsin is of very high purity. Other trypsin reagents can vary in their levels of purity. Level of purity is important for achieving positive SCoPE2 results.

Caution: Trypsin can cause skin, respiratory, and eye irritation. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood.
Vortex (Analog vortex mixer)VWRModel 58816-121
Water bath sonicator (i.e., 2.8 L ultrasonic cleaner with digital timer)VWR97043964
Water, Optima LC-MS/MS gradeFisher ScientificW6-1All solutions that need to be diluted or made are recommended to be made with mass-spectrometry grade water. Any dilutions and/or master mixes should be made fresh. Contamination resulting from lower-grade water can negatively affect peptide detection and single-cell data quality .

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