Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Neuroscience
تحليل حجم أراضي الخلايا النجمية والتبليط في أقسام الأنسجة السميكة العائمة بحرية
يصف هذا البروتوكول طرق تقسيم وتلطيخ وتصوير أقسام الأنسجة العائمة الحرة في دماغ الفأر ، متبوعا بوصف مفصل لتحليل حجم منطقة الخلايا النجمية وتداخل أراضي الخلايا النجمية أو تبليطها.
تمتلك الخلايا النجمية درجة مذهلة من التعقيد المورفولوجي الذي يمكنها من التفاعل مع كل نوع من الخلايا والبنية تقريبا داخل الدماغ. من خلال هذه التفاعلات ، تنظم الخلايا النجمية بنشاط العديد من وظائف الدماغ الحرجة ، بما في ذلك تكوين المشبك العصبي ، والنقل العصبي ، والتوازن الأيوني. في دماغ القوارض ، تنمو الخلايا النجمية في الحجم والتعقيد خلال الأسابيع الثلاثة الأولى بعد الولادة وتنشئ مناطق متميزة وغير متداخلة لتجانب الدماغ. يوفر هذا البروتوكول طريقة راسخة لتحليل حجم منطقة الخلايا النجمية وتبليط الخلايا النجمية باستخدام أقسام الأنسجة العائمة الحرة من دماغ الفأر. أولا ، يصف هذا البروتوكول خطوات جمع الأنسجة ، والتقسيم بالتبريد ، والتلطيخ المناعي لأقسام الأنسجة العائمة الحرة. ثانيا، يصف هذا البروتوكول اكتساب الصور وتحليل حجم أراضي الخلايا النجمية وحجم تداخل الأراضي، باستخدام برامج تحليل الصور المتاحة تجاريا. وأخيرا، تناقش هذه المخطوطة المزايا والاعتبارات الهامة والمزالق الشائعة والقيود المفروضة على هذه الأساليب. يتطلب هذا البروتوكول أنسجة المخ مع وضع علامات فلورية متفرقة أو فسيفسائية على الخلايا النجمية ، وهو مصمم للاستخدام مع معدات المختبر الشائعة ، والمجهر البؤري ، وبرامج تحليل الصور المتاحة تجاريا.
الخلايا النجمية هي خلايا متفرعة بشكل متقن تؤدي العديد من الوظائف المهمة في الدماغ1. في قشرة الفأر ، تؤدي الخلايا الجذعية الدبقية الشعاعية إلى ظهور الخلايا النجمية خلال المراحل الجنينية المتأخرة والمبكرة بعد الولادة2. خلال الأسابيع الثلاثة الأولى بعد الولادة ، تنمو الخلايا النجمية في الحجم والتعقيد ، وتطور الآلاف من الفروع الدقيقة التي تتفاعل مباشرة مع نقاط الاشتباك العصبي1. في الوقت نفسه ، تتفاعل الخلايا النجمية مع الخلايا النجمية المجاورة لإنشاء مناطق منفصلة وغير متداخلة لتجانب الدماغ3 ، مع الحفاظ على الاتصال عبر قنوات تقاطع الفجوة4. تتعطل ....
تم استخدام جميع الفئران وفقا للجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) في جامعة نورث كارولينا في تشابل هيل وقسم الطب المقارن (بروتوكول IACUC رقم 21-116.0). تم استخدام الفئران من كلا الجنسين في اليوم 21 بعد الولادة (P21) لهذه التجارب. تم الحصول على الفئران CD1 تجاريا (جدول المواد) ، وتم و.......
ويقدم الشكل 1 مخططا تخطيطيا للخطوات الرئيسية وسير العمل لهذا البروتوكول. يوضح الشكل 2 لقطات شاشة للخطوات الرئيسية باستخدام برنامج تحليل الصور لإنشاء سطح ، وتوليد بقع قريبة من السطح ، وإنشاء بدن محدب. يوضح الشكل 3 تطبيق هذه التقنية لتحديد تدا.......
يصف هذا البروتوكول طريقة راسخة لتحليل حجم أراضي الخلايا النجمية وتبليط الخلايا النجمية في قشرة الفأر ، مع تفصيل جميع الخطوات الرئيسية التي تبدأ بالتروية وتنتهي بتحليل الصور. يتطلب هذا البروتوكول أدمغة من الفئران التي تعبر عن البروتينات الفلورية في مجموعة متفرقة أو فسيفساء من الخلايا ال?.......
تم إجراء الفحص المجهري في مركز UNC Neuroscience Microscopy Core (RRID:SCR_019060) ، مدعوما جزئيا بتمويل من منحة دعم مركز العلوم العصبية NIH-NINDS P30 NS045892 ومنحة دعم مركز أبحاث الإعاقات الفكرية والتنموية التابع للمعاهد الوطنية للصحة النباتية - NICHD U54 HD079124. تم إنشاء الشكل 1 باستخدام BioRender.com. تتم إعادة طباعة الصور والبيانات الواردة في الشكل 4 من منشور سابق9 بإذن من الناشر.
....| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 forceps | Roboz | RS-5045 | |
| 1 mL TB Syringe | Becton Dickinson (BD) | 309623 | |
| 10x TBS (tris-buffered saline) | 30 g Tris, 80 g NaCl, 2 g KCl, HCl to pH 7.4, dH2O to 1 L; store at room temperature (RT) | ||
| 12-well plate | Genesee Scientific | 25-106MP | |
| 1x TBS | 100 mL 10x TBS + 900 mL dH2O; store at RT | ||
| 1x TBS + Heparin | 28.2 mg Heparin + 250 mL 1x TBS; store at 4 °C | ||
| 24-well plate | Genesee Scientific | 25-107MP | |
| 30% Sucrose in TBS | 15 g sucrose, 1x TBS to 50 mL; store at 4 °C | ||
| 4% PFA (paraformaldehyde) in TBS | 40 g PFA, 4-6 NaOH pellets, 100 mL 10x TBS, dH2O to 1 L; store at 4 °C | ||
| Avertin | 0.3125 g tri-bromoethanol, 0.625 mL methylbutanol, dH2O to 25 mL; store at 4 °C; discard 2 weeks after making | ||
| Blocking and antibody buffer | 10% goat serum in TBST; store at 4 °C | ||
| CD1 mice | Charles River | 022 | |
| Collection vial for brains | Fisher Scientific | 03-337-20 | |
| Confocal acquisition software | Olympous | FV31S-SW | |
| Confocal microscope | Olympus | FV3000RS | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12544E | |
| Cryostat | Thermo Scientific | CryoStar NX50 | |
| Cryostat blade | Thermo Scientific | 3052835 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Embedding mold | Polysciences | 18646A-1 | |
| Freezing Medium | 2:1 30% sucrose:OCT; store at RT | ||
| GFP antibody | Aves Labs | GFP1010 | |
| Glycerol | Thermo Scientific | 158920010 | |
| Goat anti-chicken 488 | Invitrogen | A-11039 | |
| Goat anti-rabbit 594 | Invitrogen | A11037 | |
| Goat Serum | Gibco | 16210064 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Imaris | Bitplane | N/A | Version 9.8.0 |
| MATLAB | MathWorks | N/A | |
| Metal lunch tin | AQUARIUS | N/A | From Amazon, "DIY Large Fun Box" |
| Methylbutanol | Sigma-Aldrich | 152463 | |
| Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5921 | |
| Mouting medium | 20mM Tris pH8.0, 90% Glycerol, 0.5% N-propyl gallate ; store at 4 °C; good for up to 2 months | ||
| Nailpolish | VWR | 100491-940 | |
| N-propyl gallate | Sigma-Aldrich | 02370-100G | |
| O.C.T. | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Oil | Olympus | IMMOIL-F30CC | Specific to microscope/objective |
| Operating Scissors 6" | Roboz | RS-6820 | |
| Orbital platform shaker | Fisher Scientific | 88861043 | Minimum speed needed: 25 rpm |
| Paintbrush | Bogrinuo | N/A | From Amazon, "Detail Paint Brushes - Miniature Brushes" |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Pasteur pipet (5.75") | VWR | 14672-608 | |
| Pasteur pipet (9") | VWR | 14672-380 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541-500G | |
| Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| RFP antibody | Rockland | 600-401-379 | |
| Sectioning medium | 1:1 glycerol:1x TBS; store at RT | ||
| Slides | VWR | 48311-703 | |
| Sodium chrloide | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| TBST (TBS + Triton X-100) | 0.2% Triton in 1x TBS; store at RT | ||
| Transfer Pipet | VWR | 414004-002 | |
| Tri-bromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Thermo Scientific | 424570025 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Triton X-100 (high-quality) | Fisher Scientific | 50-489-120 | |
| XTSpotsConvexHull | N/A | N/A | custom XTension provide as supplementary material |
| Buffers and Solutions | |||
| 10x TBS | xx mM Tris, xx mM NaCl, xx mM KCl, pH 7.4 | ||
| 1x TBS | |||
| 1x TBS + Heparin | add xx mg Heparin to xx mL of 1x TBS | ||
| 4% PFA | |||
| 30% Sucrose in TBS | |||
| Freezing Medium | |||
| Sectioning medium | |||
| TBST | 0.2% Triton in 1x TBS | ||
| Blocking and antibody buffer | 10% goat serum in 1x TBST | ||
| Mouting medium |
- Stogsdill, J. A., et al. Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis. Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).
- Akdemir, E. S., Huang, A. Y., Deneen, B. Astrocytogenesis: where, when, and how. F1000Research. 9, (2020).
- Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).
- Houades, V., et al. Shapes of astrocyte networks in the juvenile brain. Neuron Glia Biology. 2 (1), 3-14 (2006).
- Zuchero, J. B., Barres, B. A. Glia in mammalian development and disease. Development. 142 (22), 3805-3809 (2015).
- Srinivasan, R., et al. New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).
- Testen, A., Kim, R., Reissner, K. J. High-resolution three-dimensional imaging of individual astrocytes using confocal microscopy. Current Protocols in Neuroscience. 91 (1), 92 (2020).
- Takano, T., et al. Chemico-genetic discovery of astrocytic control of inhibition in vivo. Nature. 588 (7837), 296-302 (2020).
- Baldwin, K. T., et al. HepaCAM controls astrocyte self-organization and coupling. Neuron. 109 (15), 2427-2442 (2021).
- Amberg, N., Hippenmeyer, S. Genetic mosaic dissection of candidate genes in mice using mosaic analysis with double markers. STAR Protocols. 2 (4), 100939 (2021).
- Dumas, L., et al. In utero electroporation of multiaddressable genome-integrating color (MAGIC) markers to individualize cortical mouse astrocytes. Journal of visualized experiments: JoVE. (159), e61110 (2020).
- Garcia-Marques, J., Nunez-Llaves, R., Lopez-Mascaraque, L. NG2-glia from pallial progenitors produce the largest clonal clusters of the brain: time frame of clonal generation in cortex and olfactory bulb. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (6), 2305-2313 (2014).
- Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communication. 10 (1), 4884 (2019).
- O'Donnell, J., Ding, F., Nedergaard, M. Distinct functional states of astrocytes during sleep and wakefulness: Is norepinephrine the master regulator. Current Sleep Medicine Reports. 1 (1), 1-8 (2015).
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved