厚自由漂浮组织切片中星形胶质细胞区域体积和瓷砖的分析

该协议描述了用于切片，染色和成像小鼠大脑的自由浮动组织切片的方法，随后详细描述了星形胶质细胞区域体积和星形胶质细胞区域重叠或平铺的分析。

星形胶质细胞具有惊人的形态复杂性，使它们能够与大脑中几乎每种类型的细胞和结构相互作用。通过这些相互作用，星形胶质细胞积极调节许多关键的大脑功能，包括突触形成、神经传递和离子稳态。在啮齿动物大脑中，星形胶质细胞在产后前三周的大小和复杂性增加，并建立不同的，不重叠的领土来平铺大脑。该协议提供了一种使用来自小鼠大脑的自由浮动组织切片分析星形胶质细胞区域体积和星形胶质细胞平铺的既定方法。首先，该方案描述了自由浮动组织切片的组织收集，冷冻切片和免疫染色的步骤。其次，该协议描述了星形胶质细胞区域体积和区域重叠体积的图像采集和分析，使用市售的图像分析软件。最后，本文讨论了这些方法的优点，重要考虑因素，常见陷阱和局限性。该协议要求脑组织具有星形胶质细胞的稀疏或马赛克荧光标记，并且设计用于与常见的实验室设备，共聚焦显微镜和市售的图像分析软件一起使用。

星形胶质细胞是精心分支的细胞，在大脑中执行许多重要功能¹。在小鼠皮层中，桡骨神经胶质干细胞在胚胎晚期和产后早期^阶段2中产生星形胶质细胞。在产后的前三周，星形胶质细胞的大小和复杂性增加，形成数千个直接与突触相互作用的细枝¹。同时，星形胶质细胞与邻近的星形胶质细胞相互作用，以建立离散的、非重叠的区域来平铺大脑³，同时 通过 间隙连接通道⁴保持通信。在侮辱或损伤⁵之后的许多疾病状态中，星形胶质细胞的形态和组织被破坏，这表明这些过程对正常大脑功能的重要性。在正常发育、衰老和疾病期间分析星形胶质细胞的形态特性可以为星形胶质细胞生物学和生理学提供有价值的见解。此外，在遗传操作后分析星形胶质细胞形态是辨别控制星形胶质细胞形态复杂性的建立和维持的细胞和分子机制的宝贵工具。

由于星形胶质细胞分支的复杂性和星形胶质细胞平铺，对小鼠大脑中星形胶质细胞形态的分析很复杂。使用中间丝胶质纤维酸性蛋白（GFAP）作为星形胶质细胞特异性标记物的抗体染色仅捕获主要分支，并且大大低估了星形胶质细胞形态学复杂性¹。其他细胞特异性标记物如谷氨酸转运蛋白1（GLT-1;....

所有小鼠均按照北卡罗来纳大学教堂山分校的机构动物护理和使用委员会（IACUC）和比较医学部（IACUC协议编号21-116.0）使用。产后第21天（P21）的两性小鼠用于这些实验。以商业方式获得CD1小鼠（材料表），前面描述了MADM9的WT：WT和MADM9 WT：KO^小鼠。

注意：该协议要求在稀疏的星形胶质细胞群体中具有荧光蛋白表达的大脑。荧光蛋白表达可以通过.......

图1给出了该协议的主要步骤和工作流程的示意图。 图2 显示了使用图像分析软件生成表面，生成靠近表面的斑点并生成凸起船体的关键步骤的屏幕截图。 图3 演示了该技术在确定星形胶质胶质细胞区域重叠/平铺中的应用。在 图4中，先前发表的手稿⁹ 的代表性结果证明了该协议的应用。在 .......

该协议描述了一种用于分析小鼠皮层中星形胶质细胞区域体积和星形胶质细胞平铺的既定方法，详细介绍了从灌注开始并以图像分析结束的所有主要步骤。该协议要求在稀疏或马赛克的星形胶质细胞群中表达荧光蛋白的小鼠的大脑。除此要求外，任何年龄的小鼠都可以用于该方案，只需对灌注设置和添加到包埋模具中的冷冻介质体积进行微小的调整。虽然已经发表了用于分析脑组织切片

显微镜检查在UNC神经科学显微镜核心（RRID：SCR_019060）进行，部分由NIH-NINDS神经科学中心支持资助P30 NS045892和NIH-NICHD智力和发育障碍研究中心支持资助U54 HD079124资助。图 1 是使用 BioRender.com 创建的。图 4 中的图像和数据是在出版商的许可下从以前的出版物⁹ 转载而来的。