Analyse af astrocytterritoriumvolumen og flisebelægning i tykke fritflydende vævssektioner

Denne protokol beskriver metoder til sektionering, farvning og billeddannelse af fritsvævende vævssektioner i musehjernen efterfulgt af en detaljeret beskrivelse af analysen af astrocytområdevolumen og astrocytterritoriumoverlapning eller flisebelægning.

Astrocytter besidder en forbløffende grad af morfologisk kompleksitet, der gør det muligt for dem at interagere med næsten alle typer celler og strukturer i hjernen. Gennem disse interaktioner regulerer astrocytter aktivt mange kritiske hjernefunktioner, herunder synapsedannelse, neurotransmission og ionhomeostase. I gnaverhjernen vokser astrocytter i størrelse og kompleksitet i løbet af de første tre postnatale uger og etablerer forskellige, ikke-overlappende territorier for at flise hjernen. Denne protokol giver en etableret metode til analyse af astrocytområdevolumen og astrocytfliser ved hjælp af fritsvævende vævssektioner fra musehjernen. For det første beskriver denne protokol trinene til vævsindsamling, kryosesektion og immunostaining af fritflydende vævssektioner. For det andet beskriver denne protokol billedoptagelse og analyse af astrocytområdevolumen og territoriumoverlapningsvolumen ved hjælp af kommercielt tilgængelig billedanalysesoftware. Endelig diskuterer dette manuskript fordelene, vigtige overvejelser, almindelige faldgruber og begrænsninger ved disse metoder. Denne protokol kræver hjernevæv med sparsom eller mosaik fluorescerende mærkning af astrocytter og er designet til at blive brugt med fælles laboratorieudstyr, konfokal mikroskopi og kommercielt tilgængelig billedanalysesoftware.

Astrocytter er udførligt forgrenede celler, der udfører mange vigtige funktioner i hjernen¹. I musebarken giver radiale glialstamceller anledning til astrocytter i de sene embryonale og tidlige postnatale stadier². I løbet af de første tre postnatale uger vokser astrocytter i størrelse og kompleksitet og udvikler tusindvis af fine grene, der direkte interagerer med synapser¹. Samtidig interagerer astrocytter med tilstødende astrocytter for at etablere diskrete, ikke-overlappende territorier for at flise hjernen³, samtidig med at kommunikationen opretholdes via gap ....

Alle mus blev brugt i overensstemmelse med Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of North Carolina i Chapel Hill og Division of Comparative Medicine (IACUC protokolnummer 21-116.0). Mus af begge køn på postnatal dag 21 (P21) blev brugt til disse forsøg. CD1-mus blev opnået kommercielt (Materialetabel), og MADM9 WT:WT- og MADM9 WT:KO-mus blev beskrevet tidligere⁹.

BEMÆRK: Denne protokol kræver hjerner med fluorescerende.......

Figur 1 viser en skematisk oversigt over de vigtigste trin og arbejdsgange for denne protokol. Figur 2 viser skærmbilleder af nøgletrin ved hjælp af billedanalysesoftwaren til at generere en overflade, generere pletter tæt på overfladen og generere et konvekst skrog. Figur 3 viser anvendelsen af denne teknik til at bestemme astrocytområdeoverlapning / flisebelægning. I figur 4 viser repræsentati.......

Denne protokol beskriver en etableret metode til analyse af astrocytområdevolumen og astrocytfliser i musebarken, der beskriver alle de vigtigste trin, der begynder med perfusion og slutter med billedanalyse. Denne protokol kræver hjerner fra mus, der udtrykker fluorescerende proteiner i en sparsom eller mosaikpopulation af astrocytter. Uden for dette krav kan mus i alle aldre anvendes til denne protokol med kun mindre justeringer af perfusionsindstillinger og mængden af frysemedier tilføjet til indlejringsformen. Me.......

Mikroskopi blev udført på UNC Neuroscience Microscopy Core (RRID: SCR_019060), delvist støttet af finansiering fra NIH-NINDS Neuroscience Center Support Grant P30 NS045892 og NIH-NICHD Intellectual and Developmental Disabilities Research Center Support Grant U54 HD079124. Figur 1 blev oprettet med BioRender.com. Billederne og dataene i figur 4 er genoptrykt fra en tidligere publikation⁹ med tilladelse fra udgiveren.