Analyse van astrocytengebiedvolume en tegels in dikke vrij zwevende weefselsecties

Dit protocol beschrijft methoden voor het doorsnijden, kleuren en afbeelden van vrij zwevende weefselsecties van de muizenhersenen, gevolgd door een gedetailleerde beschrijving van de analyse van het astrocytengebiedvolume en astrocytengebied overlap of tegels.

Astrocyten bezitten een verbazingwekkende mate van morfologische complexiteit die hen in staat stelt om te interageren met bijna elk type cel en structuur in de hersenen. Door deze interacties reguleren astrocyten actief veel kritieke hersenfuncties, waaronder synapsvorming, neurotransmissie en ionhomeostase. In de hersenen van knaagdieren groeien astrocyten in grootte en complexiteit tijdens de eerste drie postnatale weken en vestigen ze verschillende, niet-overlappende gebieden om de hersenen te betegelen. Dit protocol biedt een gevestigde methode voor het analyseren van astrocytengebiedvolume en astrocytentetettegels met behulp van vrij zwevende weefselsecties uit het muizenbrein. Ten eerste beschrijft dit protocol de stappen voor weefselverzameling, cryosectie en immunostaining van vrij zwevende weefselsecties. Ten tweede beschrijft dit protocol beeldacquisitie en analyse van astrocytengebiedvolume en territoriumoverlappingsvolume, met behulp van commercieel beschikbare beeldanalysesoftware. Ten slotte bespreekt dit manuscript de voordelen, belangrijke overwegingen, veelvoorkomende valkuilen en beperkingen van deze methoden. Dit protocol vereist hersenweefsel met schaarse of mozaïek fluorescerende labeling van astrocyten en is ontworpen om te worden gebruikt met gemeenschappelijke laboratoriumapparatuur, confocale microscopie en in de handel verkrijgbare beeldanalysesoftware.

Astrocyten zijn uitgebreid vertakte cellen die veel belangrijke functies in de hersenen vervullen¹. In de cortex van de muis geven radiale gliastamcellen aanleiding tot astrocyten tijdens de late embryonale en vroege postnatale stadia². Tijdens de eerste drie postnatale weken groeien astrocyten in omvang en complexiteit en ontwikkelen ze duizenden fijne takken die rechtstreeks interageren met synapsen¹. Tegelijkertijd interageren astrocyten met naburige astrocyten om discrete, niet-overlappende gebieden vast te stellen om de hersenen te betegelen³, terwijl de communicatie <....

Alle muizen werden gebruikt in overeenstemming met de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) aan de Universiteit van North Carolina in Chapel Hill en de afdeling Vergelijkende Geneeskunde (IACUC-protocolnummer 21-116.0). Muizen van beide geslachten op postnatale dag 21 (P21) werden gebruikt voor deze experimenten. CD1-muizen werden commercieel verkregen (Tabel van materialen) en MADM9 WT: WT- en MADM9 WT: KO-muizen werden eerder beschreven⁹.

Figuur 1 geeft een schematisch overzicht van de belangrijkste stappen en workflow voor dit protocol. Figuur 2 toont screenshots van belangrijke stappen met behulp van de beeldanalysesoftware om een oppervlak te genereren, vlekken dicht bij het oppervlak te genereren en een bolle romp te genereren. Figuur 3 toont de toepassing van deze techniek om de overlap/tegels van astrocytengebied te bepalen. In figuur 4

Dit protocol beschrijft een gevestigde methode voor het analyseren van het astrocytengebiedvolume en astrocytentegels in de cortex van de muis, waarbij alle belangrijke stappen worden beschreven, beginnend met perfusie en eindigend met beeldanalyse. Dit protocol vereist hersenen van muizen die fluorescerende eiwitten tot expressie brengen in een schaarse of mozaïekpopulatie van astrocyten. Buiten deze vereiste kunnen muizen van elke leeftijd voor dit protocol worden gebruikt, met slechts kleine aanpassingen aan de perfu.......

Microscopie werd uitgevoerd in de UNC Neuroscience Microscopy Core (RRID: SCR_019060), gedeeltelijk ondersteund door financiering van de NIH-NINDS Neuroscience Center Support Grant P30 NS045892 en de NIH-NICHD Intellectual and Developmental Disabilities Research Center Support Grant U54 HD079124. Figuur 1 is gemaakt met BioRender.com. De afbeeldingen en gegevens in figuur 4 zijn met toestemming van de uitgever overgenomen uit een eerdere publicatie⁹ .