Analyse du volume et du carrelage du territoire des astrocytes dans des sections de tissus épais flottants

Ce protocole décrit des méthodes de sectionnement, de coloration et d’imagerie de sections de tissu flottant librement du cerveau de la souris, suivies d’une description détaillée de l’analyse du volume du territoire des astrocytes et du chevauchement ou du carrelage du territoire des astrocytes.

Les astrocytes possèdent un degré étonnant de complexité morphologique qui leur permet d’interagir avec presque tous les types de cellules et de structures dans le cerveau. Grâce à ces interactions, les astrocytes régulent activement de nombreuses fonctions cérébrales critiques, y compris la formation de synapses, la neurotransmission et l’homéostasie ionique. Dans le cerveau des rongeurs, les astrocytes grossissent et se complexifient au cours des trois premières semaines postnatales et établissent des territoires distincts et qui ne se chevauchent pas pour carreler le cerveau. Ce protocole fournit une méthode établie pour analyser le volume du territoire des astrocytes et le carrelage des astrocytes à l’aide de coupes de tissu flottant librement du cerveau de la souris. Tout d’abord, ce protocole décrit les étapes de la collecte de tissus, de la cryosection et de l’immunocoloration des coupes de tissus flottant librement. Deuxièmement, ce protocole décrit l’acquisition d’images et l’analyse du volume du territoire des astrocytes et du volume de chevauchement des territoires, à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images disponible dans le commerce. Enfin, ce manuscrit traite des avantages, des considérations importantes, des pièges courants et des limites de ces méthodes. Ce protocole nécessite des tissus cérébraux avec un marquage fluorescent clairsemé ou en mosaïque des astrocytes, et est conçu pour être utilisé avec l’équipement de laboratoire commun, la microscopie confocale et les logiciels d’analyse d’images disponibles dans le commerce.

Les astrocytes sont des cellules richement ramifiées qui remplissent de nombreuses fonctions importantes dans le cerveau¹. Dans le cortex de la souris, les cellules souches gliales radiales donnent naissance à des astrocytes à la fin de l’embryon et au début du stade postnatal². Au cours des trois premières semaines postnatales, les astrocytes grossissent en taille et en complexité, développant des milliers de branches fines qui interagissent directement avec les synapses¹. Simultanément, les astrocytes interagissent avec les astrocytes voisins pour établir des territoires discrets et non superpos....

Toutes les souris ont été utilisées conformément à l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Caroline du Nord à Chapel Hill et à la Division de médecine comparée (numéro de protocole 21-116.0 de l’IACUC). Des souris des deux sexes au jour postnatal 21 (P21) ont été utilisées pour ces expériences. Des souris CD1 ont été obtenues commercialement (Table des matériaux), et les souris MADM9 WT:WT et MADM9 WT:KO ont été décrites précédemment

La figure 1 présente un schéma des principales étapes et du flux de travail de ce protocole. La figure 2 montre des captures d’écran des étapes clés à l’aide du logiciel d’analyse d’images pour générer une surface, générer des taches proches de la surface et générer une coque convexe. La figure 3 illustre l’application de cette technique pour déterminer le chevauchement/carrelage du territoire des astrocytes........

Ce protocole décrit une méthode établie pour analyser le volume du territoire des astrocytes et le carrelage des astrocytes dans le cortex de la souris, détaillant toutes les étapes majeures commençant par la perfusion et se terminant par l’analyse d’images. Ce protocole nécessite des cerveaux de souris qui expriment des protéines fluorescentes dans une population clairsemée ou en mosaïque d’astrocytes. En dehors de cette exigence, des souris de tout âge peuvent être utilisées pour ce protocole, avec s.......

La microscopie a été réalisée au NOYAU DE MICROSCOPIE DES NEUROSCIENCES DE L’UNC (RRID: SCR_019060), soutenue en partie par le financement de la subvention de soutien du NIH-NINDS Neuroscience Center P30 NS045892 et de la subvention de soutien du centre de recherche sur les déficiences intellectuelles et développementales du NIH-NICHD U54 HD079124. La figure 1 a été créée avec BioRender.com. Les images et les données de la figure 4 sont réimprimées à partir d’une publication précédente⁹ avec l’autorisation de l’éditeur.