Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Neuroscience
मोटी फ्री-फ्लोटिंग ऊतक वर्गों में एस्ट्रोसाइट क्षेत्र मात्रा और टाइलिंग का विश्लेषण
यह प्रोटोकॉल माउस मस्तिष्क के सेक्शनिंग, धुंधला और इमेजिंग फ्री-फ्लोटिंग ऊतक वर्गों के तरीकों का वर्णन करता है, इसके बाद एस्ट्रोसाइट क्षेत्र की मात्रा और एस्ट्रोसाइट क्षेत्र ओवरलैप या टाइलिंग के विश्लेषण का विस्तृत विवरण होता है।
एस्ट्रोसाइट्स में रूपात्मक जटिलता की एक आश्चर्यजनक डिग्री होती है जो उन्हें मस्तिष्क के भीतर लगभग हर प्रकार की कोशिका और संरचना के साथ बातचीत करने में सक्षम बनाती है। इन इंटरैक्शन के माध्यम से, एस्ट्रोसाइट्स सक्रिय रूप से कई महत्वपूर्ण मस्तिष्क कार्यों को विनियमित करते हैं, जिसमें सिनैप्स गठन, न्यूरोट्रांसमिशन और आयन होमोस्टैसिस शामिल हैं। कृंतक मस्तिष्क में, एस्ट्रोसाइट्स पहले तीन प्रसवोत्तर हफ्तों के दौरान आकार और जटिलता में बढ़ते हैं और मस्तिष्क को टाइल करने के लिए अलग-अलग, गैर-अतिव्यापी क्षेत्रों की स्थापना करते हैं। यह प्रोटोकॉल माउस मस्तिष्क से मुक्त-फ्लोटिंग ऊतक वर्गों का उपयोग करके एस्ट्रोसाइट क्षेत्र की मात्रा और एस्ट्रोसाइट टाइलिंग का विश्लेषण करने के लिए एक स्थापित विधि प्रदान करता है। सबसे पहले, यह प्रोटोकॉल ऊतक संग्रह, क्रायोसेक्शनिंग और मुक्त-फ्लोटिंग ऊतक वर्गों के इम्यूनोस्टेनिंग के चरणों का वर्णन करता है। दूसरा, यह प्रोटोकॉल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके एस्ट्रोसाइट क्षेत्र की मात्रा और क्षेत्र ओवरलैप वॉल्यूम की छवि अधिग्रहण और विश्लेषण का वर्णन करता है। अंत में, यह पांडुलिपि इन विधियों के फायदे, महत्वपूर्ण विचार, सामान्य नुकसान और सीमाओं पर चर्चा करती है। इस प्रोटोकॉल को एस्ट्रोसाइट्स के विरल या मोज़ेक फ्लोरोसेंट लेबलिंग के साथ मस्तिष्क के ऊतकों की आवश्यकता होती है, और इसे सामान्य प्रयोगशाला उपकरण, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ उपयोग करने के लिए डिज़ाइन किया गया है।
एस्ट्रोसाइट्स विस्तृत रूप से शाखित कोशिकाएं हैं जो मस्तिष्क में कई महत्वपूर्ण कार्य करती हैं1. माउस प्रांतस्था में, रेडियल ग्लियाल स्टेम कोशिकाएं देर से भ्रूण और प्रारंभिक प्रसवोत्तर चरणों के दौरान एस्ट्रोसाइट्स को जन्म देतीहैं 2. पहले तीन प्रसवोत्तर हफ्तों के दौरान, एस्ट्रोसाइट्स आकार और जटिलता में बढ़ते हैं, हजारों ठीक शाखाओं को विकसित करते हैं जो सीधे सिनैप्सके साथ बातचीत करते हैं 1. समवर्ती रूप से, एस्ट्रोसाइट्स पड़ोसी एस्ट्रोसाइट्स के साथ मस्तिष्क 3 को टाइल करने के लिए असतत, गैर-अतिव्यापी क्षेत्रों को स्थापित करने के लिए बातचीत करते हैं, जबकि गैप जंक्शनचैनलों के मा....
चैपल हिल में उत्तरी कैरोलिना विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) और तुलनात्मक चिकित्सा विभाग (आईएसीयूसी प्रोटोकॉल नंबर 21-116.0) के अनुसार सभी चूहों का उपयोग किया गया था। प्रस.......
यह प्रोटोकॉल माउस कॉर्टेक्स में एस्ट्रोसाइट क्षेत्र की मात्रा और एस्ट्रोसाइट टाइलिंग का विश्लेषण करने के लिए एक स्थापित विधि का वर्णन करता है, छिड़काव के साथ शुरू होने वाले सभी प्रमुख चरणों का विवरण ?.......
माइक्रोस्कोपी यूएनसी न्यूरोसाइंस माइक्रोस्कोपी कोर (आरआरआईडी: SCR_019060) में किया गया था, जो एनआईएच-एनआईएनडीएस न्यूरोसाइंस सेंटर सपोर्ट ग्रांट पी 30 एनएस 045892 और एनआईएच-एनआईसीएचडी बौद्धिक और विकासात्मक विकलांगता अनुसंधान केंद्र सहायता अनुदान यू 54 एचडी 079124 से वित्त पोषण द्वारा समर्थित था। चित्रा 1 BioRender.com के साथ बनाया गया था। चित्र4 में छवियों और डेटा प्रकाशक से अनुमति के साथ एक पिछले प्रकाशन9 से पुनर्मुद्रित कर रहे हैं.
....| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 forceps | Roboz | RS-5045 | |
| 1 mL TB Syringe | Becton Dickinson (BD) | 309623 | |
| 10x TBS (tris-buffered saline) | 30 g Tris, 80 g NaCl, 2 g KCl, HCl to pH 7.4, dH2O to 1 L; store at room temperature (RT) | ||
| 12-well plate | Genesee Scientific | 25-106MP | |
| 1x TBS | 100 mL 10x TBS + 900 mL dH2O; store at RT | ||
| 1x TBS + Heparin | 28.2 mg Heparin + 250 mL 1x TBS; store at 4 °C | ||
| 24-well plate | Genesee Scientific | 25-107MP | |
| 30% Sucrose in TBS | 15 g sucrose, 1x TBS to 50 mL; store at 4 °C | ||
| 4% PFA (paraformaldehyde) in TBS | 40 g PFA, 4-6 NaOH pellets, 100 mL 10x TBS, dH2O to 1 L; store at 4 °C | ||
| Avertin | 0.3125 g tri-bromoethanol, 0.625 mL methylbutanol, dH2O to 25 mL; store at 4 °C; discard 2 weeks after making | ||
| Blocking and antibody buffer | 10% goat serum in TBST; store at 4 °C | ||
| CD1 mice | Charles River | 022 | |
| Collection vial for brains | Fisher Scientific | 03-337-20 | |
| Confocal acquisition software | Olympous | FV31S-SW | |
| Confocal microscope | Olympus | FV3000RS | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12544E | |
| Cryostat | Thermo Scientific | CryoStar NX50 | |
| Cryostat blade | Thermo Scientific | 3052835 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Embedding mold | Polysciences | 18646A-1 | |
| Freezing Medium | 2:1 30% sucrose:OCT; store at RT | ||
| GFP antibody | Aves Labs | GFP1010 | |
| Glycerol | Thermo Scientific | 158920010 | |
| Goat anti-chicken 488 | Invitrogen | A-11039 | |
| Goat anti-rabbit 594 | Invitrogen | A11037 | |
| Goat Serum | Gibco | 16210064 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Imaris | Bitplane | N/A | Version 9.8.0 |
| MATLAB | MathWorks | N/A | |
| Metal lunch tin | AQUARIUS | N/A | From Amazon, "DIY Large Fun Box" |
| Methylbutanol | Sigma-Aldrich | 152463 | |
| Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5921 | |
| Mouting medium | 20mM Tris pH8.0, 90% Glycerol, 0.5% N-propyl gallate ; store at 4 °C; good for up to 2 months | ||
| Nailpolish | VWR | 100491-940 | |
| N-propyl gallate | Sigma-Aldrich | 02370-100G | |
| O.C.T. | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Oil | Olympus | IMMOIL-F30CC | Specific to microscope/objective |
| Operating Scissors 6" | Roboz | RS-6820 | |
| Orbital platform shaker | Fisher Scientific | 88861043 | Minimum speed needed: 25 rpm |
| Paintbrush | Bogrinuo | N/A | From Amazon, "Detail Paint Brushes - Miniature Brushes" |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Pasteur pipet (5.75") | VWR | 14672-608 | |
| Pasteur pipet (9") | VWR | 14672-380 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541-500G | |
| Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| RFP antibody | Rockland | 600-401-379 | |
| Sectioning medium | 1:1 glycerol:1x TBS; store at RT | ||
| Slides | VWR | 48311-703 | |
| Sodium chrloide | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| TBST (TBS + Triton X-100) | 0.2% Triton in 1x TBS; store at RT | ||
| Transfer Pipet | VWR | 414004-002 | |
| Tri-bromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Thermo Scientific | 424570025 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Triton X-100 (high-quality) | Fisher Scientific | 50-489-120 | |
| XTSpotsConvexHull | N/A | N/A | custom XTension provide as supplementary material |
| Buffers and Solutions | |||
| 10x TBS | xx mM Tris, xx mM NaCl, xx mM KCl, pH 7.4 | ||
| 1x TBS | |||
| 1x TBS + Heparin | add xx mg Heparin to xx mL of 1x TBS | ||
| 4% PFA | |||
| 30% Sucrose in TBS | |||
| Freezing Medium | |||
| Sectioning medium | |||
| TBST | 0.2% Triton in 1x TBS | ||
| Blocking and antibody buffer | 10% goat serum in 1x TBST | ||
| Mouting medium |
- Stogsdill, J. A., et al. Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis. Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).
- Akdemir, E. S., Huang, A. Y., Deneen, B. Astrocytogenesis: where, when, and how. F1000Research. 9, (2020).
- Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).
- Houades, V., et al. Shapes of astrocyte networks in the juvenile brain. Neuron Glia Biology. 2 (1), 3-14 (2006).
- Zuchero, J. B., Barres, B. A. Glia in mammalian development and disease. Development. 142 (22), 3805-3809 (2015).
- Srinivasan, R., et al. New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).
- Testen, A., Kim, R., Reissner, K. J. High-resolution three-dimensional imaging of individual astrocytes using confocal microscopy. Current Protocols in Neuroscience. 91 (1), 92 (2020).
- Takano, T., et al. Chemico-genetic discovery of astrocytic control of inhibition in vivo. Nature. 588 (7837), 296-302 (2020).
- Baldwin, K. T., et al. HepaCAM controls astrocyte self-organization and coupling. Neuron. 109 (15), 2427-2442 (2021).
- Amberg, N., Hippenmeyer, S. Genetic mosaic dissection of candidate genes in mice using mosaic analysis with double markers. STAR Protocols. 2 (4), 100939 (2021).
- Dumas, L., et al. In utero electroporation of multiaddressable genome-integrating color (MAGIC) markers to individualize cortical mouse astrocytes. Journal of visualized experiments: JoVE. (159), e61110 (2020).
- Garcia-Marques, J., Nunez-Llaves, R., Lopez-Mascaraque, L. NG2-glia from pallial progenitors produce the largest clonal clusters of the brain: time frame of clonal generation in cortex and olfactory bulb. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (6), 2305-2313 (2014).
- Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communication. 10 (1), 4884 (2019).
- O'Donnell, J., Ding, F., Nedergaard, M. Distinct functional states of astrocytes during sleep and wakefulness: Is norepinephrine the master regulator. Current Sleep Medicine Reports. 1 (1), 1-8 (2015).
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved