Analisi del volume e della piastrellatura del territorio degli astrociti in sezioni di tessuto fluttuanti spesse

Questo protocollo descrive i metodi per il sezionamento, la colorazione e l'imaging di sezioni di tessuto fluttuanti del cervello del topo, seguito da una descrizione dettagliata dell'analisi del volume del territorio degli astrociti e della sovrapposizione o della piastrellatura del territorio degli astrociti.

Gli astrociti possiedono un sorprendente grado di complessità morfologica che consente loro di interagire con quasi ogni tipo di cellula e struttura all'interno del cervello. Attraverso queste interazioni, gli astrociti regolano attivamente molte funzioni cerebrali critiche, tra cui la formazione di sinapsi, la neurotrasmissione e l'omeostasi ionica. Nel cervello dei roditori, gli astrociti crescono in dimensioni e complessità durante le prime tre settimane postnatali e stabiliscono territori distinti e non sovrapposti per affiancare il cervello. Questo protocollo fornisce un metodo consolidato per analizzare il volume del territorio degli astrociti e la piastrellatura degli astrociti utilizzando sezioni di tessuto fluttuanti dal cervello del topo. In primo luogo, questo protocollo descrive i passaggi per la raccolta dei tessuti, la criosezione e l'immunocolorazione delle sezioni di tessuto fluttuanti. In secondo luogo, questo protocollo descrive l'acquisizione e l'analisi delle immagini del volume del territorio astrocitario e del volume di sovrapposizione del territorio, utilizzando il software di analisi delle immagini disponibile in commercio. Infine, questo manoscritto discute i vantaggi, le considerazioni importanti, le insidie comuni e i limiti di questi metodi. Questo protocollo richiede tessuto cerebrale con etichettatura fluorescente sparsa o a mosaico di astrociti ed è progettato per essere utilizzato con apparecchiature di laboratorio comuni, microscopia confocale e software di analisi delle immagini disponibile in commercio.

Gli astrociti sono cellule riccamente ramificate che svolgono molte funzioni importanti nel cervello¹. Nella corteccia del topo, le cellule staminali gliali radiali danno origine ad astrociti durante gli stadi embrionale tardivo e postnatale precoce². Durante le prime tre settimane postnatali, gli astrociti crescono in dimensioni e complessità, sviluppando migliaia di rami fini che interagiscono direttamente con le sinapsi¹. Allo stesso tempo, gli astrociti interagiscono con gli astrociti vicini per stabilire territori discreti e non sovrapposti per affiancare il cervello³,....

Tutti i topi sono stati utilizzati in conformità con l'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso l'Università della Carolina del Nord a Chapel Hill e la Divisione di Medicina Comparata (numero di protocollo IACUC 21-116.0). Topi di entrambi i sessi al giorno postnatale 21 (P21) sono stati utilizzati per questi esperimenti. I topi CD1 sono stati ottenuti commercialmente (Tabella dei materiali) e i topi MADM9 WT: WT e MADM9 WT: KO sono stati descritti in precedenza⁹

Nella Figura 1 viene presentata una descrizione schematica dei passaggi principali e del flusso di lavoro per questo protocollo. La Figura 2 mostra schermate dei passaggi chiave che utilizzano il software di analisi delle immagini per generare una superficie, generare punti vicino alla superficie e generare uno scafo convesso. La Figura 3 mostra l'applicazione di questa tecnica per determinare la sovrapposizione/piastrellatura del t.......

Questo protocollo descrive un metodo consolidato per analizzare il volume del territorio degli astrociti e la piastrellatura degli astrociti nella corteccia del topo, dettagliando tutti i passaggi principali che iniziano con la perfusione e terminano con l'analisi delle immagini. Questo protocollo richiede cervelli di topi che esprimono proteine fluorescenti in una popolazione sparsa o mosaica di astrociti. Al di fuori di questo requisito, i topi di qualsiasi età possono essere utilizzati per questo protocollo, con solo.......

La microscopia è stata eseguita presso l'UNC Neuroscience Microscopy Core (RRID: SCR_019060), supportata in parte dai finanziamenti del NIH-NINDS Neuroscience Center Support Grant P30 NS045892 e del NIH-NICHD Intellectual and Developmental Disabilities Research Center Support Grant U54 HD079124. La Figura 1 è stata creata con BioRender.com. Le immagini e i dati nella Figura 4 sono ristampati da una precedente pubblicazione⁹ con il permesso dell'editore.