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Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Neuroscience
성상 세포 영토 부피 분석 및 두꺼운 자유 부유 조직 절편의 타일링
이 프로토콜은 마우스 뇌의 자유 부유 조직 절편을 절편화, 염색 및 이미징하는 방법을 설명하고, 이어서 성상세포 영역 부피 및 성상세포 영역 중첩 또는 타일링의 분석에 대한 상세한 설명을 설명한다.
성상세포는 뇌 내의 거의 모든 유형의 세포 및 구조와 상호 작용할 수있게 해주는 놀라운 수준의 형태 학적 복잡성을 가지고 있습니다. 이러한 상호 작용을 통해 성상 세포는 시냅스 형성, 신경 전달 및 이온 항상성을 포함한 많은 중요한 뇌 기능을 적극적으로 조절합니다. 설치류 뇌에서 성상 세포는 출생 후 처음 세 주 동안 크기와 복잡성이 증가하고 뇌를 타일링하기 위해 뚜렷하고 겹치지 않는 영역을 확립합니다. 이 프로토콜은 마우스 뇌에서 자유 부유 조직 절편을 사용하여 성상 세포 영역 부피 및 성상 세포 타일링을 분석하기위한 확립 된 방법을 제공합니다. 먼저, 이 프로토콜은 자유 부유 조직 절편의 조직 수집, 냉동 절제술 및 면역염색을 위한 단계를 기술한다. 둘째,이 프로토콜은 상업적으로 이용 가능한 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 성상 세포 영토 부피 및 영토 중첩 부피의 이미지 획득 및 분석을 설명합니다. 마지막으로,이 원고는 이러한 방법의 장점, 중요한 고려 사항, 일반적인 함정 및 한계에 대해 논의합니다. 이 프로토콜은 성상세포의 희소 또는 모자이크 형광 표지를 가진 뇌 조직을 필요로 하며, 일반적인 실험실 장비, 공초점 현미경 및 상업적으로 이용가능한 이미지 분석 소프트웨어와 함께 사용하도록 설계되었다.
성상세포는 뇌에서 많은 중요한 기능을 수행하는 정교하게 분지된 세포이다1. 마우스 피질에서, 방사상 신경교세포 줄기 세포는 후기 배아 및 초기 산후 단계2 동안 성상세포를 발생시킨다. 출생 후 처음 세 주 동안, 성상세포는 크기와 복잡성이 증가하여 시냅스와 직접 상호 작용하는 수천 개의 미세한 가지를 개발합니다1. 동시에, 성상세포는 이웃하는 성상세포와 상호작용하여 갭 접합 채널(4)을 통한 통신을 유지하면서 뇌(3)를 타일링하기 위해 이산적이고 겹치지 않는 영역을 구축한다. 성상세포 형태학 및 조직은 모욕 또는 상해5 후 많은 질병 상태에서 붕괴되며, 이는 적절한 뇌 기능을 위한 이러한 과정의 중요성을 나타낸다. 정상적인 발달, 노화 및 질병 동안 성상 세포 형태 학적 특성을 분석하면 성상 세포 생물학 및 생리학에 대한 귀중한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 또한, 유전자 조작에 따른 성상세포 형태학의 분석은 성상세포 형태학적 복잡성의 확립 및 유지를 지배하는 세포 및 분자 메커니즘을 식별하기 위한 귀중한 도구이다.
모든 마우스는 채플 힐의 노스 캐롤라이나 대학 (University of North Carolina)의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 및 비교 의학 부문 (IACUC 프로토콜 번호 21-116.0)에 따라 사용되었습니다. 출생 후 21일째에 남녀 모두의 마우스(P21)를 이들 실험에 사용하였다. CD1 마우스는 상업적으로 수득되었고(표 물질), MADM9 WT:WT 및 MADM9 WT:KO 마우스는 앞서9에 기술하였다.
이 프로토콜은 마우스 피질에서 성상세포 영역 부피 및 성상세포 타일링을 분석하기 위한 확립된 방법을 설명하며, 관류로 시작하여 이미지 분석으로 끝나는 모든 주요 단계를 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 성상세포의 희소 또는 모자이크 집단에서 형광 단백질을 발현하는 마우스의 뇌를 필요로 한다. 이 요구 사항 외에, 임의의 연령의 마우스가 이 프로토콜에 사용될 수 있으며, 관류 설정?.......
현미경 검사는 UNC 신경 과학 현미경 코어 (RRID : SCR_019060)에서 수행되었으며, NIH-NINDS 신경 과학 센터 지원 보조금 P30 NS045892 및 NIH-NICHD 지적 발달 장애 연구 센터 지원 보조금 U54 HD079124의 기금으로 부분적으로 지원되었습니다. 그림 1은 BioRender.com 로 작성되었습니다. 그림 4의 이미지와 데이터는 출판사의 허가를 받아 이전 간행물(9 )에서 재인쇄된다.
....| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 forceps | Roboz | RS-5045 | |
| 1 mL TB Syringe | Becton Dickinson (BD) | 309623 | |
| 10x TBS (tris-buffered saline) | 30 g Tris, 80 g NaCl, 2 g KCl, HCl to pH 7.4, dH2O to 1 L; store at room temperature (RT) | ||
| 12-well plate | Genesee Scientific | 25-106MP | |
| 1x TBS | 100 mL 10x TBS + 900 mL dH2O; store at RT | ||
| 1x TBS + Heparin | 28.2 mg Heparin + 250 mL 1x TBS; store at 4 °C | ||
| 24-well plate | Genesee Scientific | 25-107MP | |
| 30% Sucrose in TBS | 15 g sucrose, 1x TBS to 50 mL; store at 4 °C | ||
| 4% PFA (paraformaldehyde) in TBS | 40 g PFA, 4-6 NaOH pellets, 100 mL 10x TBS, dH2O to 1 L; store at 4 °C | ||
| Avertin | 0.3125 g tri-bromoethanol, 0.625 mL methylbutanol, dH2O to 25 mL; store at 4 °C; discard 2 weeks after making | ||
| Blocking and antibody buffer | 10% goat serum in TBST; store at 4 °C | ||
| CD1 mice | Charles River | 022 | |
| Collection vial for brains | Fisher Scientific | 03-337-20 | |
| Confocal acquisition software | Olympous | FV31S-SW | |
| Confocal microscope | Olympus | FV3000RS | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12544E | |
| Cryostat | Thermo Scientific | CryoStar NX50 | |
| Cryostat blade | Thermo Scientific | 3052835 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Embedding mold | Polysciences | 18646A-1 | |
| Freezing Medium | 2:1 30% sucrose:OCT; store at RT | ||
| GFP antibody | Aves Labs | GFP1010 | |
| Glycerol | Thermo Scientific | 158920010 | |
| Goat anti-chicken 488 | Invitrogen | A-11039 | |
| Goat anti-rabbit 594 | Invitrogen | A11037 | |
| Goat Serum | Gibco | 16210064 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Imaris | Bitplane | N/A | Version 9.8.0 |
| MATLAB | MathWorks | N/A | |
| Metal lunch tin | AQUARIUS | N/A | From Amazon, "DIY Large Fun Box" |
| Methylbutanol | Sigma-Aldrich | 152463 | |
| Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5921 | |
| Mouting medium | 20mM Tris pH8.0, 90% Glycerol, 0.5% N-propyl gallate ; store at 4 °C; good for up to 2 months | ||
| Nailpolish | VWR | 100491-940 | |
| N-propyl gallate | Sigma-Aldrich | 02370-100G | |
| O.C.T. | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Oil | Olympus | IMMOIL-F30CC | Specific to microscope/objective |
| Operating Scissors 6" | Roboz | RS-6820 | |
| Orbital platform shaker | Fisher Scientific | 88861043 | Minimum speed needed: 25 rpm |
| Paintbrush | Bogrinuo | N/A | From Amazon, "Detail Paint Brushes - Miniature Brushes" |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Pasteur pipet (5.75") | VWR | 14672-608 | |
| Pasteur pipet (9") | VWR | 14672-380 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541-500G | |
| Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| RFP antibody | Rockland | 600-401-379 | |
| Sectioning medium | 1:1 glycerol:1x TBS; store at RT | ||
| Slides | VWR | 48311-703 | |
| Sodium chrloide | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| TBST (TBS + Triton X-100) | 0.2% Triton in 1x TBS; store at RT | ||
| Transfer Pipet | VWR | 414004-002 | |
| Tri-bromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Thermo Scientific | 424570025 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Triton X-100 (high-quality) | Fisher Scientific | 50-489-120 | |
| XTSpotsConvexHull | N/A | N/A | custom XTension provide as supplementary material |
| Buffers and Solutions | |||
| 10x TBS | xx mM Tris, xx mM NaCl, xx mM KCl, pH 7.4 | ||
| 1x TBS | |||
| 1x TBS + Heparin | add xx mg Heparin to xx mL of 1x TBS | ||
| 4% PFA | |||
| 30% Sucrose in TBS | |||
| Freezing Medium | |||
| Sectioning medium | |||
| TBST | 0.2% Triton in 1x TBS | ||
| Blocking and antibody buffer | 10% goat serum in 1x TBST | ||
| Mouting medium |
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