Analyse av astrocyttområdevolum og flislegging i tykke friflytende vevsseksjoner

Denne protokollen beskriver metoder for seksjonering, farging og avbildning av frittflytende vevsseksjoner av musehjernen, etterfulgt av en detaljert beskrivelse av analysen av astrocyttområdevolum og astrocyttområdeoverlapping eller flislegging.

Astrocytter har en forbløffende grad av morfologisk kompleksitet som gjør dem i stand til å samhandle med nesten alle typer celler og strukturer i hjernen. Gjennom disse interaksjonene regulerer astrocytter aktivt mange kritiske hjernefunksjoner, inkludert synapsedannelse, nevrotransmisjon og ion homeostase. I gnagerhjernen vokser astrocytter i størrelse og kompleksitet i løpet av de tre første postnatale ukene og etablerer distinkte, ikke-overlappende territorier for å flislegge hjernen. Denne protokollen gir en etablert metode for å analysere astrocyttområdevolum og astrocyttfliser ved hjelp av frittflytende vevsseksjoner fra musehjernen. For det første beskriver denne protokollen trinnene for vevsinnsamling, kryooseksjon og immunstaining av frittflytende vevsseksjoner. For det andre beskriver denne protokollen bildeanskaffelse og analyse av astrocyttområdevolum og territoriumoverlappingsvolum, ved hjelp av kommersielt tilgjengelig programvare for bildeanalyse. Til slutt diskuterer dette manuskriptet fordelene, viktige hensyn, vanlige fallgruver og begrensninger ved disse metodene. Denne protokollen krever hjernevev med sparsom eller mosaikk fluorescerende merking av astrocytter, og er designet for å brukes med vanlig laboratorieutstyr, konfiskert mikroskopi og kommersielt tilgjengelig bildeanalyseprogramvare.

Astrocytter er forseggjort forgrenede celler som utfører mange viktige funksjoner i hjernen¹. I musebarken gir radiale glial stamceller opphav til astrocytter i de sene embryonale og tidlige postnatale stadiene². I løpet av de tre første postnatale ukene vokser astrocytter i størrelse og kompleksitet, og utvikler tusenvis av fine grener som direkte samhandler med synapser¹. Samtidig samhandler astrocytter med nærliggende astrocytter for å etablere diskrete, ikke-overlappende territorier for å flislegge hjernen³, samtidig som kommunikasjonen opprettholdes via gapkry....

Alle mus ble brukt i samsvar med Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of North Carolina ved Chapel Hill og Division of Comparative Medicine (IACUC-protokollnummer 21-116.0). Mus av begge kjønn på barseldag 21 (P21) ble brukt til disse eksperimentene. CD1-mus ble oppnådd kommersielt (Materialliste), og MADM9 WT:WT- og MADM9 WT:KO-mus ble beskrevet tidligere⁹.

MERK: Denne protokollen krever hjerner med fluorescerende prote.......

Figur 1 viser en skjematisk oversikt over hovedtrinnene og arbeidsflyten for denne protokollen. Figur 2 viser skjermbilder av viktige trinn ved hjelp av bildeanalyseprogramvaren for å generere en overflate, generere flekker nær overflaten og generere et konveks skrog. Figur 3 viser anvendelsen av denne teknikken for å bestemme astrocyttområdeoverlapping/-flislegging. I figur 4 viser representative r.......

Denne protokollen beskriver en etablert metode for å analysere astrocyttområdevolum og astrocyttfliser i musebarken, som beskriver alle de viktigste trinnene som begynner med perfusjon og slutter med bildeanalyse. Denne protokollen krever hjerner fra mus som uttrykker fluorescerende proteiner i en sparsom eller mosaikkpopulasjon av astrocytter. Utenfor dette kravet kan mus i alle aldre brukes til denne protokollen, med bare mindre justeringer av perfusjonsinnstillinger og volumet av frysemedier lagt til innebyggingsfor.......

Mikroskopi ble utført ved UNC Neuroscience Microscopy Core (RRID:SCR_019060), delvis støttet av finansiering fra NIH-NINDS Neuroscience Center Support Grant P30 NS045892 og NIH-NICHD Intellectual and Developmental Disabilities Research Center Support Grant U54 HD079124. Figur 1 ble opprettet med BioRender.com. Bildene og dataene i figur 4 skrives ut på nytt fra en tidligere publikasjon⁹ med tillatelse fra utgiveren.