Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Neuroscience
Análise do volume do território de astutação e revestimento em seções de tecido livre grossa
Este protocolo descreve métodos de seção, coloração e seções de tecido flutuante de imagem do cérebro do camundongo, seguido por uma descrição detalhada da análise do volume de território de astrócito e da sobreposição de território de astrócito.
Os astrócitos possuem um grau surpreendente de complexidade morfológica que lhes permite interagir com quase todos os tipos de células e estruturas dentro do cérebro. Através dessas interações, os astrócitos regulam ativamente muitas funções cerebrais críticas, incluindo formação de sinapse, neurotransmissão e homeostase de íon. No cérebro dos roedores, os astrócitos crescem em tamanho e complexidade durante as três primeiras semanas pós-natal e estabelecem territórios distintos e não sobrepostos para ladrilhos cerebrais. Este protocolo fornece um método estabelecido para analisar o volume do território de astrócito e astuta usando seções de tecido flutuante livre do cérebro do camundongo. Primeiro, este protocolo descreve os passos para a coleta de tecidos, criosectioning e imunostaining de seções de tecido flutuante livre. Em segundo lugar, este protocolo descreve a aquisição e análise de imagens do volume de território de astrócito e do volume de sobreposição de território, utilizando software de análise de imagem comercialmente disponível. Por fim, este manuscrito discute as vantagens, considerações importantes, armadilhas comuns e limitações desses métodos. Este protocolo requer tecido cerebral com rotulagem fluorescente esparsa ou mosaico de astrócitos, e foi projetado para ser usado com equipamentos de laboratório comuns, microscopia confocal e software de análise de imagem comercialmente disponível.
Os astrócitos são células elaboradas que desempenham muitas funções importantes no cérebro1. No córtex do camundongo, as células-tronco gliais radiais dão origem a astrócitos durante os estágios pós-nataltardios e iniciais 2. Durante as três primeiras semanas pós-natal, os astrócitos crescem em tamanho e complexidade, desenvolvendo milhares de ramos finos que interagem diretamente com as sinapses1. Simultaneamente, os astrócitos interagem com os astrócitos vizinhos para estabelecer territórios discretos e não sobrepostos para ladrilhos cerebrais3, mantendo a comunicação
Todos os camundongos foram utilizados de acordo com o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill e a Divisão de Medicina Comparada (protocolo IACUC número 21-116.0). Camundongos de ambos os sexos no pós-natal dia 21 (P21) foram usados para esses experimentos. Os camundongos CD1 foram obtidos comercialmente (Tabela de Materiais), e os ratos MADM9 WT:WT e MADM9 WT:KO foram descritos anteriormente9.
A Figura 1 apresenta um esboço esquemático das principais etapas e fluxo de trabalho para este protocolo. A Figura 2 mostra capturas de tela de etapas-chave usando o software de análise de imagem para gerar uma superfície, gerar manchas próximas à superfície e gerar um casco convexo. A Figura 3 demonstra a aplicação desta técnica para determinar a sobreposição/inclinação do território astrócito. Na
Este protocolo descreve um método estabelecido para analisar o volume do território de astrócito e astúcia no córtex do rato, detalhando todos os principais passos que começam com a perfusão e terminam com a análise de imagem. Este protocolo requer cérebros de camundongos que expressam proteínas fluorescentes em uma população esparsa ou mosaico de astrócitos. Fora este requisito, ratos de qualquer idade podem ser usados para este protocolo, com apenas pequenos ajustes nas configurações de perfusão e o vol.......
A microscopia foi realizada no Núcleo de Microscopia de Neurociência da UNC (RRID:SCR_019060), apoiado em parte pelo financiamento do NIH-NINDS Neuroscience Center Support Grant P30 NS045892 e do NIH-NICHD Intellectual and Developmental Disabilities Research Center Support Grant U54 HD079124. A Figura 1 foi criada com BioRender.com. As imagens e dados da Figura 4 são reimpressos de uma publicação anterior9 com permissão do editor.
....| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 forceps | Roboz | RS-5045 | |
| 1 mL TB Syringe | Becton Dickinson (BD) | 309623 | |
| 10x TBS (tris-buffered saline) | 30 g Tris, 80 g NaCl, 2 g KCl, HCl to pH 7.4, dH2O to 1 L; store at room temperature (RT) | ||
| 12-well plate | Genesee Scientific | 25-106MP | |
| 1x TBS | 100 mL 10x TBS + 900 mL dH2O; store at RT | ||
| 1x TBS + Heparin | 28.2 mg Heparin + 250 mL 1x TBS; store at 4 °C | ||
| 24-well plate | Genesee Scientific | 25-107MP | |
| 30% Sucrose in TBS | 15 g sucrose, 1x TBS to 50 mL; store at 4 °C | ||
| 4% PFA (paraformaldehyde) in TBS | 40 g PFA, 4-6 NaOH pellets, 100 mL 10x TBS, dH2O to 1 L; store at 4 °C | ||
| Avertin | 0.3125 g tri-bromoethanol, 0.625 mL methylbutanol, dH2O to 25 mL; store at 4 °C; discard 2 weeks after making | ||
| Blocking and antibody buffer | 10% goat serum in TBST; store at 4 °C | ||
| CD1 mice | Charles River | 022 | |
| Collection vial for brains | Fisher Scientific | 03-337-20 | |
| Confocal acquisition software | Olympous | FV31S-SW | |
| Confocal microscope | Olympus | FV3000RS | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12544E | |
| Cryostat | Thermo Scientific | CryoStar NX50 | |
| Cryostat blade | Thermo Scientific | 3052835 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Embedding mold | Polysciences | 18646A-1 | |
| Freezing Medium | 2:1 30% sucrose:OCT; store at RT | ||
| GFP antibody | Aves Labs | GFP1010 | |
| Glycerol | Thermo Scientific | 158920010 | |
| Goat anti-chicken 488 | Invitrogen | A-11039 | |
| Goat anti-rabbit 594 | Invitrogen | A11037 | |
| Goat Serum | Gibco | 16210064 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Imaris | Bitplane | N/A | Version 9.8.0 |
| MATLAB | MathWorks | N/A | |
| Metal lunch tin | AQUARIUS | N/A | From Amazon, "DIY Large Fun Box" |
| Methylbutanol | Sigma-Aldrich | 152463 | |
| Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5921 | |
| Mouting medium | 20mM Tris pH8.0, 90% Glycerol, 0.5% N-propyl gallate ; store at 4 °C; good for up to 2 months | ||
| Nailpolish | VWR | 100491-940 | |
| N-propyl gallate | Sigma-Aldrich | 02370-100G | |
| O.C.T. | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Oil | Olympus | IMMOIL-F30CC | Specific to microscope/objective |
| Operating Scissors 6" | Roboz | RS-6820 | |
| Orbital platform shaker | Fisher Scientific | 88861043 | Minimum speed needed: 25 rpm |
| Paintbrush | Bogrinuo | N/A | From Amazon, "Detail Paint Brushes - Miniature Brushes" |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Pasteur pipet (5.75") | VWR | 14672-608 | |
| Pasteur pipet (9") | VWR | 14672-380 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541-500G | |
| Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| RFP antibody | Rockland | 600-401-379 | |
| Sectioning medium | 1:1 glycerol:1x TBS; store at RT | ||
| Slides | VWR | 48311-703 | |
| Sodium chrloide | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| TBST (TBS + Triton X-100) | 0.2% Triton in 1x TBS; store at RT | ||
| Transfer Pipet | VWR | 414004-002 | |
| Tri-bromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Thermo Scientific | 424570025 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Triton X-100 (high-quality) | Fisher Scientific | 50-489-120 | |
| XTSpotsConvexHull | N/A | N/A | custom XTension provide as supplementary material |
| Buffers and Solutions | |||
| 10x TBS | xx mM Tris, xx mM NaCl, xx mM KCl, pH 7.4 | ||
| 1x TBS | |||
| 1x TBS + Heparin | add xx mg Heparin to xx mL of 1x TBS | ||
| 4% PFA | |||
| 30% Sucrose in TBS | |||
| Freezing Medium | |||
| Sectioning medium | |||
| TBST | 0.2% Triton in 1x TBS | ||
| Blocking and antibody buffer | 10% goat serum in 1x TBST | ||
| Mouting medium |
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