Análisis del volumen del territorio de astrocitos y mosaicos en secciones gruesas de tejido de flotación libre

Este protocolo describe métodos para seccionar, teñir e obtener imágenes de secciones de tejido flotantes del cerebro del ratón, seguidos de una descripción detallada del análisis del volumen del territorio de los astrocitos y la superposición o mosaico del territorio de los astrocitos.

Los astrocitos poseen un asombroso grado de complejidad morfológica que les permite interactuar con casi todos los tipos de células y estructuras dentro del cerebro. A través de estas interacciones, los astrocitos regulan activamente muchas funciones cerebrales críticas, incluida la formación de sinapsis, la neurotransmisión y la homeostasis iónica. En el cerebro de los roedores, los astrocitos crecen en tamaño y complejidad durante las primeras tres semanas postnatales y establecen territorios distintos y no superpuestos para alicatar el cerebro. Este protocolo proporciona un método establecido para analizar el volumen del territorio de los astrocitos y el mosaico de astrocitos utilizando secciones de tejido que flotan libremente del cerebro del ratón. En primer lugar, este protocolo describe los pasos para la recolección de tejidos, la criosecciona y la inmunotinción de secciones de tejido que flotan libremente. En segundo lugar, este protocolo describe la adquisición de imágenes y el análisis del volumen del territorio de los astrocitos y el volumen de superposición del territorio, utilizando el software de análisis de imágenes disponible comercialmente. Por último, este manuscrito discute las ventajas, consideraciones importantes, trampas comunes y limitaciones de estos métodos. Este protocolo requiere tejido cerebral con marcado fluorescente escaso o mosaico de astrocitos, y está diseñado para ser utilizado con equipos de laboratorio comunes, microscopía confocal y software de análisis de imágenes disponible comercialmente.

Los astrocitos son células elaboradamente ramificadas que realizan muchas funciones importantes en el cerebro¹. En la corteza del ratón, las células madre gliales radiales dan lugar a astrocitos durante las etapas embrionaria tardía y postnatal temprana². Durante las tres primeras semanas postnatales, los astrocitos crecen en tamaño y complejidad, desarrollando miles de ramas finas que interactúan directamente con las sinapsis¹. Al mismo tiempo, los astrocitos interactúan con los astrocitos vecinos para establecer territorios discretos y no superpuestos para alicatar el cerebro^3<....

Todos los ratones se utilizaron de acuerdo con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill y la División de Medicina Comparada (número de protocolo IACUC 21-116.0). Se utilizaron ratones de ambos sexos en el día postnatal 21 (P21) para estos experimentos. Los ratones CD1 se obtuvieron comercialmente (Tabla de Materiales), y los ratones MADM9 WT:WT y MADM9 WT:KO fueron descritos previamente⁹.

La Figura 1 presenta un esquema esquemático de los principales pasos y flujo de trabajo para este protocolo. La Figura 2 muestra capturas de pantalla de pasos clave utilizando el software de análisis de imágenes para generar una superficie, generar manchas cerca de la superficie y generar un casco convexo. La Figura 3 demuestra la aplicación de esta técnica para determinar la superposición/mosaico del territorio de los astroci.......

Este protocolo describe un método establecido para analizar el volumen del territorio de astrocitos y el mosaico de astrocitos en la corteza del ratón, detallando todos los pasos principales que comienzan con la perfusión y terminan con el análisis de imágenes. Este protocolo requiere cerebros de ratones que expresan proteínas fluorescentes en una población escasa o en mosaico de astrocitos. Fuera de este requisito, se pueden usar ratones de cualquier edad para este protocolo, con solo ajustes menores en la config.......

La microscopía se realizó en el NÚCLEO de Microscopía de Neurociencia de la UNC (RRID: SCR_019060), apoyado en parte por la subvención de apoyo del Centro de Neurociencia NIH-NINDS P30 NS045892 y la subvención de apoyo del Centro de Investigación de Discapacidades Intelectuales y del Desarrollo NIH-NICHD U54 HD079124. La Figura 1 se creó con BioRender.com. Las imágenes y los datos de la Figura 4 se reimprimen de una publicación anterior⁹ con permiso del editor.