Analys av astrocyterritoriets volym och plattsättning i tjocka fritt flytande vävnadssektioner

Detta protokoll beskriver metoder för sektionering, färgning och avbildning av fritt flytande vävnadssektioner i mushjärnan, följt av en detaljerad beskrivning av analysen av astrocytrevirvolym och astrocytreviröverlappning eller kakel.

Astrocyter har en häpnadsväckande grad av morfologisk komplexitet som gör det möjligt för dem att interagera med nästan alla typer av celler och strukturer i hjärnan. Genom dessa interaktioner reglerar astrocyter aktivt många kritiska hjärnfunktioner, inklusive synapsbildning, neurotransmission och jonhomeostas. I gnagarhjärnan växer astrocyter i storlek och komplexitet under de första tre postnatala veckorna och etablerar distinkta, icke-överlappande territorier för att kakla hjärnan. Detta protokoll tillhandahåller en etablerad metod för att analysera astrocytrevirvolym och astrocytplattor med hjälp av fritt flytande vävnadssektioner från mushjärnan. För det första beskriver detta protokoll stegen för vävnadsuppsamling, kryosektion och immunfärgning av fritt flytande vävnadssektioner. För det andra beskriver detta protokoll bildförvärv och analys av astrocytterritoriumvolym och områdesöverlappningsvolym med hjälp av kommersiellt tillgänglig bildanalysprogramvara. Slutligen diskuterar detta manuskript fördelarna, viktiga överväganden, vanliga fallgropar och begränsningar med dessa metoder. Detta protokoll kräver hjärnvävnad med gles eller mosaik fluorescerande märkning av astrocyter och är utformad för att användas med vanlig laboratorieutrustning, konfokalmikroskopi och kommersiellt tillgänglig bildanalysprogramvara.

Astrocyter är utstuderat grenade celler som utför många viktiga funktioner i hjärnan¹. I musbarken ger radiella glialstamceller upphov till astrocyter under de sena embryonala och tidiga postnatala stadierna². Under de första tre postnatala veckorna växer astrocyter i storlek och komplexitet och utvecklar tusentals fina grenar som direkt interagerar med synapser¹. Samtidigt interagerar astrocyter med angränsande astrocyter för att etablera diskreta, icke-överlappande territorier för att kakla hjärnan³, samtidigt som kommunikationen upprätthålls via gapkorsningskana....

Alla möss användes i enlighet med Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid University of North Carolina at Chapel Hill och Division of Comparative Medicine (IACUC-protokollnummer 21-116.0). Möss av båda könen vid postnatal dag 21 (P21) användes för dessa experiment. CD1-möss erhölls kommersiellt (materialtabell), och MADM9 WT: WT och MADM9 WT: KO-möss beskrevs tidigare⁹.

OBS: Detta protokoll kräver hjärnor med fluorescerande p.......

I bild 1 visas en schematisk översikt över de viktigaste stegen och arbetsflödet för det här protokollet. Figur 2 visar skärmdumpar av viktiga steg med hjälp av bildanalysprogramvaran för att generera en yta, generera fläckar nära ytan och generera ett konvext skrov. Figur 3 visar tillämpningen av denna teknik för att bestämma astrocytreviröverlappning/plattsättning. I figur 4 visar repre.......

Detta protokoll beskriver en etablerad metod för att analysera astrocytrevirvolym och astrocytplattor i musbarken, som beskriver alla de viktigaste stegen som börjar med perfusion och slutar med bildanalys. Detta protokoll kräver hjärnor från möss som uttrycker fluorescerande proteiner i en gles eller mosaikpopulation av astrocyter. Utanför detta krav kan möss i alla åldrar användas för detta protokoll, med endast mindre justeringar av perfusionsinställningar och volymen frysmedia som läggs till i inbäddnin.......

Mikroskopi utfördes vid UNC Neuroscience Microscopy Core (RRID: SCR_019060), delvis med stöd av finansiering från NIH-NINDS Neuroscience Center Support Grant P30 NS045892 och NIH-NICHD Intellectual and Developmental Disabilities Research Center Support Grant U54 HD079124. Bild 1 skapades med BioRender.com. Bilderna och uppgifterna i figur 4 återges från en tidigare publikation⁹ med tillstånd från förlaget.