使用数字液滴聚合酶链反应测量单细胞线粒体DNA拷贝数和异质性

在这里，我们提出了一种用于测量单细胞中绝对线粒体（mt）DNA拷贝数和mtDNA缺失异质水平的方案。

哺乳动物线粒体（mt）DNA是一种小的环状双链线粒体内DNA分子，编码电子传递链的13个亚基。与二倍体核基因组不同，大多数细胞含有更多的mtDNA拷贝，根据细胞类型，从不到100个拷贝到超过20万个拷贝不等。MtDNA拷贝数越来越多地被用作许多与年龄相关的退行性疾病和疾病的生物标志物，因此，mtDNA拷贝数的准确测量正在成为研究和诊断环境中的关键工具。mtDNA中的突变通常以单核苷酸多态性（SNP）或缺失的形式发生，可以存在于细胞内mtDNA的所有拷贝中（称为同质），也可以作为突变和WT mtDNA拷贝的混合物（称为异质）。异质性mtDNA突变是临床线粒体病理学的主要原因，无论是在罕见疾病中还是在越来越多的常见迟发性疾病（如帕金森病）中。确定细胞中存在的异质性水平是诊断罕见线粒体疾病和旨在了解线粒体可能发挥作用的常见迟发性疾病的研究的关键步骤。传统上，MtDNA拷贝数和异质性通过基于定量（q）PCR的测定或深度测序来测量。然而，最近引入的ddPCR技术为测量这两个参数提供了一种替代方法。与现有方法相比，它具有几个优点，包括能够测量绝对mtDNA拷贝数和足够的灵敏度，即使在低拷贝数下也能从单个细胞进行准确测量。这里介绍的是描述使用ddPCR测量单细胞中mtDNA拷贝数的详细方案，此后称为液滴生成PCR，可以选择同时测量具有mtDNA缺失的细胞中的异质性。还讨论了扩展该方法以测量具有mtDNA SNP的细胞中的异质性的可能性。

哺乳动物线粒体 （mt）DNA 是一种小的（约 16.5 Kb）环状 DNA 基因组，存在于线粒体基质中，编码 37 个基因，包括两个 rRNA、22 个 tRNA 和 13 个蛋白质编码基因¹。与每个细胞包含每个基因的一个（单倍体）或两个（二倍体）拷贝的核基因组不同，mtDNA存在于每个细胞的线粒体中有多个拷贝，范围从数十个拷贝（例如，成熟的精子细胞）到数十万个拷贝（例如，卵母细胞）^2，3。这种多拷贝性质的结果是mtDNA基因组中的突变，可能以单核苷酸多态性（SNP），缺失或重复的形式存在，可以在任何给定细胞中以不同的水平存在，占细胞总mtDNA群体的0%至100%。同一细胞中野生型和突变型mtDNA基因组的存在称为异质性，致病性异质性mtDNA突变是线粒体疾病的主要原因，几种常见的神经系统综合征与潜在的异质性mtDNA突变有关⁴。

导致临床疾病的异质性mtDNA突变可能性的两个关键参数是异质水平和mtDNA拷贝数。许多异质突变表现出阈值效应，生化和临床表型仅在某个异质水平以上变得明显，通常约为80%⁵，随后随着异质^{性的进一步增加}而恶化4。然而，考虑细胞中存在的mtDN....

所有实验均遵循ARRIVE指南，并获得了剑桥大学动物福利伦理审查机构（AWERB）的批准。

注意：液滴生成之前的所有样品制备步骤必须在干净的PCR前工作区进行，最好尽可能在紫外线灭菌的柜子中进行。此处描述的方案使用特定的液滴生成PCR设备（参见 材料表），虽然通用方法应适用于其他系统，但建议参考制造商关于引物/探针浓度，PCR循环条件等的指南，因为?.......

液滴产生后，可见一层透明的不透明液滴漂浮在每口井的油相顶部（图1B）。在对单细胞进行实验时，输入裂解物中存在去垢剂会对液滴形成产生不利影响。使用2.1.2.中描述的裂解方案，尽管最终样品中存在少量TWEEN-20残留量，但液滴产量仍可常规达到推荐水平10，000以上（图1C）。然而，使用其他裂解缓冲液，例如缓冲液RLT Plus，形成的液滴数量显着减.......

除上述细胞类型和物种外，此处描述的方案还适用于多种细胞类型和物种，尽管仔细优化新的检测设计将是确保在远离先前验证的引物/探针组合时保持方法准确性和可重复性的关键。在使用单细胞时，确保尽可能准确地进行样品收集（例如，在通过FACS分选细胞时使用严格的单细胞参数）以确保获得的结果真实反映单个细胞的结果，并确保所有准备工作都在干净的PCR前区域进行，以降低发生污染?.......

感谢L Bozhilova博士对液滴生成PCR数据的统计分析的建议。感谢H Zhang博士提供用于生成 图3C 和 图4B中的数据的卵母细胞。这项工作由剑桥大学医学研究委员会线粒体生物学部门（MC_UU_00015/9）的SPB进行，并由PFC持有的威康信托基金会首席研究奖学金（212219 / Z / 18 / Z）资助。