Måling af enkeltcellet mitokondrie-DNA-kopinummer og heteroplasmi ved hjælp af digital dråbepolymerasekædereaktion

Her præsenterer vi en protokol til måling af absolut mitokondrie (mt) DNA-kopinummer og mtDNA-sletning heteroplasmaniveauer i enkeltceller.

Pattedyrs mitokondrie-DNA (mt) er et lille, cirkulært, dobbeltstrenget, intra-mitokondrie-DNA-molekyle, der koder for 13 underenheder af elektrontransportkæden. I modsætning til det diploide nukleare genom indeholder de fleste celler mange flere kopier af mtDNA, der spænder fra mindre end 100 til over 200.000 kopier afhængigt af celletype. MtDNA-kopinummer bruges i stigende grad som biomarkør for en række aldersrelaterede degenerative tilstande og sygdomme, og dermed bliver nøjagtig måling af mtDNA-kopinummeret et nøgleværktøj i både forskning og diagnostiske indstillinger. Mutationer i mtDNA, der ofte forekommer som enkeltnukleotidpolymorfier (SNP'er) eller deletioner, kan enten eksistere i alle kopier af mtDNA i cellen (kaldet homoplasmati) eller som en blanding af muterede og WT mtDNA-kopier (kaldet heteroplasmatik). Heteroplasmatiske mtDNA-mutationer er en væsentlig årsag til klinisk mitokondriepatologi, enten i sjældne sygdomme eller i et stigende antal almindelige senfølgesygdomme som Parkinsons sygdom. Bestemmelse af niveauet af heteroplasma, der er til stede i celler, er et kritisk skridt i diagnosen af sjældne mitokondriesygdomme og i forskning, der sigter mod at forstå almindelige senindsættende lidelser, hvor mitokondrier kan spille en rolle. MtDNA-kopinummer og heteroplasmi er traditionelt blevet målt ved kvantitative (q) PCR-baserede assays eller dyb sekventering. Den nylige introduktion af ddPCR-teknologi har imidlertid givet en alternativ metode til måling af begge parametre. Det giver flere fordele i forhold til eksisterende metoder, herunder evnen til at måle absolut mtDNA-kopinummer og tilstrækkelig følsomhed til at foretage nøjagtige målinger fra enkeltceller selv ved lave kopinumre. Her præsenteres en detaljeret protokol, der beskriver målingen af mtDNA-kopinummer i enkeltceller ved hjælp af ddPCR, kaldet dråbegenerering PCR fremover, med mulighed for samtidig måling af heteroplasma i celler med mtDNA-deletioner. Muligheden for at udvide denne metode til at måle heteroplasma i celler med mtDNA SNP'er diskuteres også.

Mammalian mitokondrie (mt) DNA er et lille (ca. 16,5 Kb), cirkulært DNA-genom, der befinder sig i mitokondriematrixen, der koder for 37 gener, der omfatter to rRNA'er, 22 tRNA'er og 13 proteinkodende gener¹. I modsætning til det nukleare genom, som indeholder en (haploid) eller to (diploide) kopier af hvert gen pr. celle, er mtDNA til stede i flere kopier i mitokondrierne i hver celle, lige fra snesevis af kopier (f.eks. Modne spermatocytter) til hundredtusinder af kopier (f.eks. Oocytter)^2,3. En konsekvens af denne multi-copy natur er, at mutationer i mtDNA-genomet, som kan eksistere s....

Alle eksperimenter fulgte ARRIVE-retningslinjerne og blev godkendt af University of Cambridge Animal Welfare Ethical Review Body (AWERB).

BEMÆRK: Alle prøveforberedelsestrin inden dråbegenerering skal udføres i et rent præ-PCR-arbejdsområde, ideelt i et UV-steriliseret skab, hvor det er muligt. Den her beskrevne protokol anvender specifikt PCR-udstyr til dråbegenerering (se Materialetabel), og selvom den generelle metode bør kunne anvendes på andre systemer, anbefales.......

Efter dråbegenerering er et klart lag af uigennemsigtige dråber synligt, der flyder oven på oliefasen i hver brønd (figur 1B). Dråbedannelse kan påvirkes negativt af tilstedeværelsen af vaskemidler i inputlysatet, når der udføres forsøg på enkeltceller. Ved hjælp af lysisprotokollen beskrevet i punkt 2.1.2 opnås der rutinemæssigt dråbeudbytter over det anbefalede niveau på 10.000 på trods af tilstedeværelsen af en lille restmængde TWEEN-20 i den endelige prøve (

Den protokol, der er beskrevet her, gælder på tværs af en lang række celletyper og arter ud over dem, der er diskuteret ovenfor, selvom omhyggelig optimering af nye analysedesign vil være nøglen til at sikre, at metodens nøjagtighed og repeterbarhed opretholdes, når man bevæger sig væk fra tidligere validerede primer / sondekombinationer. Når man arbejder med enkeltceller, er det vigtigt at sikre, at prøveindsamlingen udføres så nøjagtigt som muligt (f.eks. ved hjælp af strenge enkeltcelleparametre ved so.......

Tak til Dr. L Bozhilova for råd om den statistiske analyse af PCR-data fra dråbegenerering. Tak til Dr. H Zhang for at levere de oocytter, der bruges til at generere data i figur 3C og figur 4B. Dette arbejde blev udført af SPB ved Medical Research Council Mitochondrial Biology Unit (MC_UU_00015/9), University of Cambridge, og finansieret af et Wellcome Trust Principal Research Fellowship afholdt af PFC (212219/Z/18/Z).