Het meten van eencellig mitochondriaal DNA-kopienummer en heteroplasmie met behulp van digitale druppelpolymerasekettingreactie

Hier presenteren we een protocol voor het meten van absolute mitochondriale (mt) DNA-kopienummer en mtDNA-deletie heteroplasmieniveaus in enkele cellen.

Het mitochondriaal (mt)DNA van zoogdieren is een klein, circulair, dubbelstrengs, intra-mitochondriaal DNA-molecuul, dat codeert voor 13 subeenheden van de elektronentransportketen. In tegenstelling tot het diploïde nucleaire genoom, bevatten de meeste cellen veel meer kopieën van mtDNA, variërend van minder dan 100 tot meer dan 200.000 kopieën, afhankelijk van het celtype. MtDNA-kopienummer wordt steeds vaker gebruikt als biomarker voor een aantal leeftijdsgebonden degeneratieve aandoeningen en ziekten, en dus wordt nauwkeurige meting van het mtDNA-kopienummer een belangrijk hulpmiddel in zowel onderzoeks- als diagnostische instellingen. Mutaties in het mtDNA, vaak optredend als single nucleotide polymorfismen (SNP's) of deleties, kunnen ofwel voorkomen in alle kopieën van het mtDNA in de cel (homoplasmie genoemd) of als een mengsel van gemuteerde en WT mtDNA-kopieën (heteroplasmie genoemd). Heteroplasmatische mtDNA-mutaties zijn een belangrijke oorzaak van klinische mitochondriale pathologie, hetzij bij zeldzame ziekten of bij een groeiend aantal veel voorkomende ziekten met late aanvang, zoals de ziekte van Parkinson. Het bepalen van het niveau van heteroplasmie in cellen is een cruciale stap in de diagnose van zeldzame mitochondriale ziekten en in onderzoek gericht op het begrijpen van veel voorkomende late-onset aandoeningen waarbij mitochondriën een rol kunnen spelen. MtDNA-kopienummer en heteroplasmie worden traditioneel gemeten door kwantitatieve (q)PCR-gebaseerde assays of deep sequencing. De recente introductie van ddPCR-technologie heeft echter een alternatieve methode opgeleverd voor het meten van beide parameters. Het biedt verschillende voordelen ten opzichte van bestaande methoden, waaronder de mogelijkheid om het absolute mtDNA-kopieernummer te meten en voldoende gevoeligheid om nauwkeurige metingen uit afzonderlijke cellen uit te voeren, zelfs bij lage kopieeraantallen. Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd dat de meting van het mtDNA-kopienummer in afzonderlijke cellen beschrijft met behulp van ddPCR, voortaan aangeduid als druppelgeneratie PCR, met de optie voor gelijktijdige meting van heteroplasmie in cellen met mtDNA-deleties. De mogelijkheid om deze methode uit te breiden om heteroplasmie te meten in cellen met mtDNA SNP's wordt ook besproken.

Zoogdier mitochondriaal (mt)DNA is een klein (ca. 16,5 Kb), circulair DNA-genoom dat zich bevindt in de mitochondriale matrix die codeert voor 37 genen, bestaande uit twee rRNA's, 22 tRNA's en 13 eiwitcoderende genen¹. In tegenstelling tot het nucleaire genoom, dat één (haploïde) of twee (diploïde) kopieën van elk gen per cel bevat, is mtDNA aanwezig in meerdere kopieën in de mitochondriën van elke cel, variërend van tientallen kopieën (bijv. Volwassen spermatocyten) tot honderdduizenden kopieën (bijv. Eicellen)^2,3. Een gevolg van deze multi-copy aard is dat mutaties in het mtDNA-genoom....

Alle experimenten volgden de ARRIVE-richtlijnen en werden goedgekeurd door de University of Cambridge Animal Welfare Ethical Review Body (AWERB).

OPMERKING: Alle monstervoorbereidingsstappen voorafgaand aan het genereren van druppels moeten worden uitgevoerd in een schoon pre-PCR-werkgebied, idealiter waar mogelijk in een UV-gesteriliseerde kast. Het hier beschreven protocol maakt gebruik van specifieke PCR-apparatuur voor druppelgeneratie (zie materiaaltabel), en hoewel de al.......

Na het genereren van druppels is een duidelijke laag ondoorzichtige druppels zichtbaar die bovenop de oliefase in elke put drijven (figuur 1B). Druppelvorming kan nadelig worden beïnvloed door de aanwezigheid van detergentia in het inputlysaat bij het uitvoeren van experimenten op afzonderlijke cellen. Met behulp van het in 2.1.2 beschreven lysisprotocol worden routinematig druppelopbrengsten boven het aanbevolen niveau van 10.000 bereikt, ondanks de aanwezigheid van een kleine resterende h.......

Het hier beschreven protocol is van toepassing op een breed scala aan celtypen en soorten naast de hierboven besproken, hoewel zorgvuldige optimalisatie van nieuwe testontwerpen de sleutel zal zijn om ervoor te zorgen dat de nauwkeurigheid en herhaalbaarheid van de methode behouden blijven wanneer u weggaat van eerder gevalideerde primer / probe-combinaties. Bij het werken met afzonderlijke cellen is het van vitaal belang om ervoor te zorgen dat de monsterverzameling zo nauwkeurig mogelijk wordt uitgevoerd (bijvoorbeeld .......

Dank aan Dr. L Bozhilova voor advies over de statistische analyse van PCR-gegevens voor druppelgeneratie. Dank aan Dr. H Zhang voor het verstrekken van de eicellen die worden gebruikt om gegevens te genereren in figuur 3C en figuur 4B. Dit werk werd uitgevoerd door SPB van de Medical Research Council Mitochondrial Biology Unit (MC_UU_00015/9), Universiteit van Cambridge, en gefinancierd door een Wellcome Trust Principal Research Fellowship gehouden door PFC (212219 / Z / 18 / Z).