Mesure du nombre de copies d’ADN mitochondrial unicellulaire et de l’hétéroplasmie à l’aide d’une réaction en chaîne par gouttelettes numériques par polymérase

Nous présentons ici un protocole pour mesurer le nombre absolu de copies d’ADN mitochondrial (mt) et les niveaux d’hétéroplasmie de délétion de l’ADNmt dans des cellules individuelles.

L’ADN mitochondrial (mt) des mammifères est une petite molécule d’ADN intra-mitochondrial circulaire, double brin, codant pour 13 sous-unités de la chaîne de transport d’électrons. Contrairement au génome nucléaire diploïde, la plupart des cellules contiennent beaucoup plus de copies d’ADNmt, allant de moins de 100 à plus de 200 000 copies selon le type de cellule. Le nombre de copies d’ADNmt est de plus en plus utilisé comme biomarqueur pour un certain nombre de maladies et de maladies dégénératives liées à l’âge et, par conséquent, la mesure précise du nombre de copies d’ADNmt devient un outil clé dans les contextes de recherche et de diagnostic. Les mutations dans l’ADNmt, se produisant souvent sous forme de polymorphismes mononucléotidiques (SNP) ou de délétions, peuvent exister dans toutes les copies de l’ADNmt dans la cellule (appelé homoplasmie) ou sous la forme d’un mélange de copies mutées et d’ADNmt WT (appelées hétéroplasmie). Les mutations hétéroplasmiques de l’ADNmt sont une cause majeure de pathologie mitochondriale clinique, que ce soit dans les maladies rares ou dans un nombre croissant de maladies courantes d’apparition tardive telles que la maladie de Parkinson. La détermination du niveau d’hétéroplasmie présente dans les cellules est une étape critique dans le diagnostic des maladies mitochondriales rares et dans la recherche visant à comprendre les troubles courants d’apparition tardive où les mitochondries peuvent jouer un rôle. Le nombre de copies d’ADNmt et l’hétéroplasmie ont traditionnellement été mesurés par des tests quantitatifs basés sur la (q)PCR ou le séquençage profond. Cependant, l’introduction récente de la technologie ddPCR a fourni une méthode alternative pour mesurer les deux paramètres. Il offre plusieurs avantages par rapport aux méthodes existantes, y compris la capacité de mesurer le nombre absolu de copies d’ADNmt et une sensibilité suffisante pour effectuer des mesures précises à partir de cellules individuelles, même à un faible nombre de copies. Présenté ici est un protocole détaillé décrivant la mesure du nombre de copies d’ADNmt dans des cellules individuelles à l’aide de ddPCR, appelée PCR de génération de gouttelettes dorénavant, avec l’option de mesure simultanée de l’hétéroplasmie dans les cellules présentant des délétions d’ADNmt. La possibilité d’étendre cette méthode pour mesurer l’hétéroplasmie dans les cellules avec des SNP d’ADNmt est également discutée.

L’ADN mitochondrial (mt) des mammifères est un petit génome d’ADN circulaire (environ 16,5 Kb) résidant dans la matrice mitochondriale qui code pour 37 gènes, comprenant deux ARNr, 22 ARNt et 13 gènes codant pour des protéines¹. Contrairement au génome nucléaire, qui contient une copie (haploïde) ou deux copies (diploïdes) de chaque gène par cellule, l’ADNmt est présent en plusieurs copies dans les mitochondries de chaque cellule, allant de dizaines de copies (par exemple, spermatocytes matures) à des centaines de milliers de copies (par exemple, des ovocytes)^2,3. Une conséquence de cet....

Toutes les expériences ont suivi les directives ARRIVE et ont été approuvées par l’organisme d’examen éthique du bien-être animal de l’Université de Cambridge (AWERB).

REMARQUE : Toutes les étapes de préparation des échantillons avant la génération de gouttelettes doivent être effectuées dans une aire de travail pré-PCR propre, idéalement dans une armoire stérilisée aux UV si possible. Le protocole décrit ici utilise un équipement de PCR spécifique de génération de.......

Après la génération de gouttelettes, une couche transparente de gouttelettes opaques est visible flottant au-dessus de la phase pétrolière dans chaque puits (Figure 1B). La formation de gouttelettes peut être affectée négativement par la présence de détergents dans le lysat d’entrée lors de la réalisation d’expériences sur des cellules individuelles. En utilisant le protocole de lyse décrit au point 2.1.2., des rendements en gouttelettes supérieurs au niveau recommandé de.......

Le protocole décrit ici est applicable à un large éventail de types de cellules et d’espèces en plus de ceux discutés ci-dessus, bien qu’une optimisation minutieuse des nouveaux modèles de dosage soit essentielle pour garantir que la précision et la répétabilité de la méthode sont maintenues lors de l’abandon des combinaisons amorce/sonde précédemment validées. Lorsque vous travaillez avec des cellules individuelles, il est essentiel de s’assurer que le prélèvement d’échantillons est effectué .......

Merci au Dr L Bozhilova pour ses conseils sur l’analyse statistique des données de PCR de génération de gouttelettes. Merci au Dr H Zhang d’avoir fourni les ovocytes utilisés pour générer les données de la figure 3C et de la figure 4B. Ce travail a été réalisé par SPB à l’unité de biologie mitochondriale du Medical Research Council (MC_UU_00015/9) de l’Université de Cambridge et financé par une bourse de recherche principale du Wellcome Trust détenue par PFC (212219/Z/18/Z).