Messung der einzelligen mitochondrialen DNA-Kopienzahl und Heteroplasmie mittels digitaler Tröpfchenpolymerase-Kettenreaktion

Hier stellen wir ein Protokoll zur Messung der absoluten mitochondrialen (mt)DNA-Kopienzahl und der mtDNA-Deletionsheteroplasmie in einzelnen Zellen vor.

Die mitochondriale (mt)DNA von Säugetieren ist ein kleines, zirkuläres, doppelsträngiges, intramitochondriales DNA-Molekül, das 13 Untereinheiten der Elektronentransportkette kodiert. Im Gegensatz zum diploiden Kerngenom enthalten die meisten Zellen viel mehr Kopien der mtDNA, die je nach Zelltyp von weniger als 100 bis über 200.000 Kopien reichen. Die MtDNA-Kopienzahl wird zunehmend als Biomarker für eine Reihe von altersbedingten degenerativen Erkrankungen und Krankheiten verwendet, und daher wird die genaue Messung der mtDNA-Kopienzahl zu einem Schlüsselinstrument sowohl in der Forschung als auch in der Diagnose. Mutationen in der mtDNA, die oft als Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) oder Deletionen auftreten, können entweder in allen Kopien der mtDNA innerhalb der Zelle (Homoplasmie genannt) oder als Mischung aus mutierten und WT-mtDNA-Kopien (Heteroplasmie genannt) existieren. Heteroplasmatische mtDNA-Mutationen sind eine Hauptursache für klinische mitochondriale Pathologie, entweder bei seltenen Krankheiten oder bei einer wachsenden Anzahl von häufigen spät einsetzenden Krankheiten wie der Parkinson-Krankheit. Die Bestimmung des Grades der Heteroplasmie in Zellen ist ein kritischer Schritt bei der Diagnose seltener mitochondrialer Erkrankungen und in der Forschung, die darauf abzielt, häufige spät einsetzende Störungen zu verstehen, bei denen Mitochondrien eine Rolle spielen können. MtDNA-Kopienzahl und Heteroplasmie wurden traditionell durch quantitative (q)PCR-basierte Assays oder Tiefensequenzierung gemessen. Die jüngste Einführung der ddPCR-Technologie hat jedoch eine alternative Methode zur Messung beider Parameter bereitgestellt. Es bietet mehrere Vorteile gegenüber bestehenden Methoden, einschließlich der Möglichkeit, die absolute mtDNA-Kopienzahl zu messen, und einer ausreichenden Empfindlichkeit, um auch bei niedrigen Kopienzahlen genaue Messungen von einzelnen Zellen durchzuführen. Hier wird ein detailliertes Protokoll vorgestellt, das die Messung der mtDNA-Kopienzahl in einzelnen Zellen mittels ddPCR beschreibt, im Folgenden als Tröpfchenerzeugungs-PCR bezeichnet, mit der Option zur gleichzeitigen Messung der Heteroplasmie in Zellen mit mtDNA-Deletionen. Die Möglichkeit, diese Methode zur Messung von Heteroplasmen in Zellen mit mtDNA-SNPs zu erweitern, wird ebenfalls diskutiert.

Die mitochondriale (mt)DNA von Säugetieren ist ein kleines (ca. 16,5 Kb), zirkuläres DNA-Genom, das sich in der mitochondrialen Matrix befindet und 37 Gene kodiert, bestehend aus zwei rRNAs, 22 tRNAs und 13 proteinkodierenden^{Genen 1}. Im Gegensatz zum Kerngenom, das eine (haploide) oder zwei (diploide) Kopien jedes Gens pro Zelle enthält, ist mtDNA in mehreren Kopien in den Mitochondrien jeder Zelle vorhanden, die von Dutzenden von Kopien (z. B. reife Spermatozyten) bis zu Hunderttausenden von Kopien (z. B. Eizellen^{) reichen2,3}. Eine Folge dieser Multi-Copy-Natur ist, dass Mutationen im ....

Alle Experimente folgten den ARRIVE-Richtlinien und wurden vom University of Cambridge Animal Welfare Ethical Review Body (AWERB) genehmigt.

HINWEIS: Alle Probenvorbereitungsschritte vor der Tröpfchenerzeugung müssen in einem sauberen Pre-PCR-Arbeitsbereich durchgeführt werden, idealerweise nach Möglichkeit in einem UV-sterilisierten Schrank. Das hier beschriebene Protokoll verwendet spezifische PCR-Geräte zur Tröpfchenerzeugung (siehe Materialtabelle), und obwohl die al.......

Nach der Tröpfchenerzeugung ist eine klare Schicht undurchsichtiger Tröpfchen sichtbar, die auf der Ölphase in jedem Bohrloch schwimmt (Abbildung 1B). Die Tröpfchenbildung kann durch das Vorhandensein von Detergenzien im Eingangslysat bei Experimenten an einzelnen Zellen beeinträchtigt werden. Unter Verwendung des in Abschnitt 2.1.2 beschriebenen Lyseprotokolls werden trotz des Vorhandenseins einer geringen Restmenge von TWEEN-20 in der Endprobe routinemäßig Tröpfchenausbeuten über .......

Das hier beschriebene Protokoll ist zusätzlich zu den oben beschriebenen auf eine Vielzahl von Zelltypen und -spezies anwendbar, obwohl eine sorgfältige Optimierung neuer Assay-Designs von entscheidender Bedeutung sein wird, um sicherzustellen, dass Genauigkeit und Wiederholbarkeit der Methode erhalten bleiben, wenn man sich von zuvor validierten Primer/Sonden-Kombinationen entfernt. Bei der Arbeit mit Einzelzellen ist es wichtig, sicherzustellen, dass die Probenentnahme so genau wie möglich durchgeführt wird (z. B. .......

Vielen Dank an Dr. L Bozhilova für die Beratung zur statistischen Analyse von PCR-Daten zur Tröpfchenerzeugung. Vielen Dank an Dr. H Zhang für die Bereitstellung der Eizellen, die zur Generierung von Daten in Abbildung 3C und Abbildung 4B verwendet wurden. Diese Arbeit wurde von SPB an der Medical Research Council Mitochondrial Biology Unit (MC_UU_00015/9) der University of Cambridge durchgeführt und durch ein Wellcome Trust Principal Research Fellowship von PFC (212219 / Z / 18 / Z) finanziert.