Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Medicine
כאן אנו מציגים פרוטוקול למדידת מספר עותק דנ"א מיטוכונדריאלי מוחלט (mt)DNA ורמות הטרופלזמה של מחיקת mtDNA בתאים בודדים.
דנ"א מיטוכונדריאלי של יונקים (mt)DNA הוא מולקולת דנ"א תוך-מיטוכונדריאלית קטנה, מעגלית, דו-גדילית, המקודדת 13 תת-יחידות של שרשרת הובלת האלקטרונים. שלא כמו הגנום הגרעיני הדיפלואידי, רוב התאים מכילים הרבה יותר עותקים של mtDNA, החל מפחות מ-100 ועד למעלה מ-200,000 עותקים, תלוי בסוג התא. מספר עותק MtDNA משמש יותר ויותר כסמן ביולוגי למספר מצבים ניווניים ומחלות הקשורות לגיל, ולכן, מדידה מדויקת של מספר עותק mtDNA הופכת לכלי מרכזי הן במסגרות מחקר והן בהגדרות אבחון. מוטציות ב-mtDNA, המתרחשות לעתים קרובות כפולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים (SNPs) או כמחיקות, יכולות להתקיים בכל העותקים של ה-mtDNA בתוך התא (המכונה הומופלסמיות) או כתערובת של עותקי mtDNA שעברו מוטציה ו-WT (המכונים הטרופלזמה). מוטציות mtDNA הטרופלזמיות הן הגורם העיקרי לפתולוגיה מיטוכונדריאלית קלינית, בין אם במחלות נדירות או במספר גדל והולך של מחלות נפוצות מאוחרות כגון מחלת פרקינסון. קביעת רמת ההטרופלזמה הקיימת בתאים היא שלב קריטי באבחון מחלות מיטוכונדריאליות נדירות ובמחקר שמטרתו להבין הפרעות נפוצות מאוחרות שבהן המיטוכונדריה עשויה לשחק תפקיד. מספר עותק MtDNA והטרופלזמה נמדדו באופן מסורתי על ידי בדיקות כמותיות (q)מבוססות PCR או ריצוף עמוק. עם זאת, ההקדמה האחרונה של טכנולוגיית ddPCR סיפקה שיטה חלופית למדידת שני הפרמטרים. הוא מציע מספר יתרונות על פני שיטות קיימות, כולל היכולת למדוד מספר עותק mtDNA מוחלט ורגישות מספקת כדי לבצע מדידות מדויקות מתאים בודדים גם במספרי העתקה נמוכים. מוצג כאן פרוטוקול מפורט המתאר את המדידה של מספר עותק mtDNA בתאים בודדים באמצעות ddPCR, המכונה ייצור טיפות PCR מעתה ואילך, עם אפשרות למדידה בו זמנית של הטרופלזמה בתאים עם מחיקות mtDNA. כמו כן נדונה האפשרות להרחיב שיטה זו למדידת הטרופלזמה בתאים עם SNPs mtDNA.
דנ"א מיטוכונדריאלי של יונקים (mt)DNA הוא גנום דנ"א מעגלי קטן (כ-16.5 קילובייט) השוכן במטריצה המיטוכונדריאלית המקודדת 37 גנים, הכוללים שני rRNA, 22 tRNA ו-13 גנים המקודדים חלבונים1. בניגוד לגנום הגרעיני, המכיל עותק אחד (הפלואידי) או שניים (דיפלואידים) של כל גן לכל תא, mtDNA נמצא במספר עותקים במיטוכונדריה של כל תא, החל מעשרות עותקים (למשל, זרעונים בוגרים) ועד מאות אלפי עותקים (למשל, ביציות)2,3. תוצאה של ריבוי עותקים זה היא שמוטציות בגנום mtDNA, שעשויות להתקיים כפולימורפיזמים חד-נוקלאוטידים (SNPs), מחיקות או כפילויות, יכולות להימצא ברמות משתנות בכל תא נתון, ולהוות בין 0% ל-100% מכלל אוכלוס....
כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות ARRIVE ואושרו על ידי גוף הביקורת האתית לרווחת בעלי חיים של אוניברסיטת קיימברידג' (AWERB).
הערה: כל שלבי ההכנה לדוגמה לפני יצירת הטיפות חייבים להתבצע באזור עבודה נקי לפני PCR, באופן אידיאלי בארון מעוקר UV במידת האפשר. הפרוטוקול המתואר כאן משתמש בציוד PCR.......
לאחר יצירת הטיפות, ניתן לראות שכבה ברורה של טיפות אטומות מרחפת מעל שלב השמן בכל באר (איור 1B). היווצרות טיפות יכולה להיות מושפעת לרעה על ידי נוכחות של דטרגנטים בליזאט קלט בעת ביצוע ניסויים על תאים בודדים. באמצעות פרוטוקול התזה המתואר ב-2.1.2., תפוקות טיפות מעל הרמה המומלצת של 10,00.......
הפרוטוקול המתואר כאן ישים על פני מגוון רחב של סוגי תאים ומינים בנוסף לאלה שנדונו לעיל, אם כי אופטימיזציה זהירה של עיצובי בדיקה חדשים תהיה המפתח להבטיח שהדיוק והחזרתיות של השיטה נשמרים כאשר מתרחקים משילובי פריימר/בדיקה שאומתו בעבר. כאשר עובדים עם תאים בודדים, חיוני לוודא שאיסוף הדגימות מת?.......
תודה לד"ר ל. בוז'ילובה על הייעוץ לגבי הניתוח הסטטיסטי של נתוני PCR של דור טיפות. תודה לד"ר ה. ג'אנג על שסיפק את הביציות ששימשו להפקת נתונים באיור 3C ובאיור 4B. עבודה זו בוצעה על ידי SPB ביחידה לביולוגיה מיטוכונדריאלית של המועצה למחקר רפואי (MC_UU_00015/9), אוניברסיטת קיימברידג', ומומנה על ידי מלגת מחקר ראשית של Wellcome Trust המוחזקת על ידי PFC (212219/Z/18/Z).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
50% Tween-20 solution | Novex | 3005 | |
Automated droplet-generating oil | Bio Rad | 1864110 | Commercial oil formulation used to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.1) |
C1000 PCR machine with deep-well block | Bio Rad | 1851197 | PCR thermocycler equipped with a deep-well heating block, used for cell lysis (Protocol Step 2.1.2.) and PCR cycling (Protocol Step 5) |
Collection plate cooling block | Bio Rad | 12002819 | Cooling block that keeps samples chilled during droplet generation (used in Protocol step 4.3) |
ddPCR 96-well plates | Bio Rad | 12001925 | 96-well plates pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator, used for sample preparation (Protocol step 3.4) and droplet collection (Protocol step 4.3) |
ddPCR droplet reader oil | Bio Rad | 1863004 | Commercial oil formulation used by the droplet reader (used in Protocol step 6.1) |
ddPCR Supermix for Probes (no dUTP) | Bio Rad | 1863023 | Commercial supermix for use in ddPCR experiments utilising probes (used in Protocol Step 3.3) |
DG32 automated droplet generator cartridges | Bio Rad | 1864108 | Microfluidic cartridges used in the QX200 AutoDG droplet generator to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.3) |
Fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | Qualified fetal bovine serum |
Foil plate covers | Bio Rad | 1814040 | Foil plate covers used to seal droplet collection plates after droplet generation (used in Protocol step 4.6) |
HEK 293T cells | Takara | 632180 | Commercial subclone of the transformed human embryonic kidney cell line, HEK 293, expressing the SV40 Large-T antigen |
HeLa cells | ECACC | 93021013 | Human cervix epitheloid carcinoma cells |
High glucose DMEM | Gibco | 13345364 | 4.5g/L D-Glucose, with L-glutamine and sodium pyruvate |
Human cybrids | University of Miami | ||
Mouse embryonic fibroblasts | Newcastle University | Immortalized from C57Bl/6 mice | |
Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | |
PCR plate seals | Pierce | SP-0027 | Clear adhesive plate seals, only used pre-droplet generation (foil seal must be used in step 4.6) |
Pipet Tip Waste Bins | Bio Rad | 1864125 | Disposable collection bin used to collect discarded tips in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3) |
Pipet tips for AutoDG system | Bio Rad | 1864120 | Filtered pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3) |
Primary human dermal fibroblast cells | Newcastle Biobank | ||
Primers/Probes | IDT | N/A | Exact primer/probe sequences will be assay dependent. Primers and probes used in this study are given in Table 1 |
Proteinase K 20 mg/mL solution | Ambion | AM2546 | |
PX1 PCR plate sealer | Bio Rad | 1814000 | Applies foil seals to ddPCR sample plates after droplet generation (used in Protocol Step 4.6) |
QX Manager software | Bio Rad | 12012172 | Droplet reader set up & analysis software (used in Protocol Steps 6 & 7) |
QX200 AutoDG droplet generator | Bio Rad | 1864101 | Automated microfluidic droplet generator (used in Protocol Step 4) |
QX200 droplet reader | Bio Rad | 1864003 | Droplet reader (used in Protocol Step 6) |
Trizma pre-set crystals pH 8.3 | Sigma | T8943-100G |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved