Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Medicine
यहां हम एकल कोशिकाओं में पूर्ण माइटोकॉन्ड्रियल (एमटी) डीएनए कॉपी नंबर और एमटीडीएनए विलोपन हेटरोप्लाज्मी स्तर को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
स्तनधारी माइटोकॉन्ड्रियल (एमटी) डीएनए एक छोटा, गोलाकार, डबल-फंसे हुए, इंट्रा-माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए अणु है, जो इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला के 13 सबयूनिट्स को एन्कोडिंग करता है। द्विगुणित परमाणु जीनोम के विपरीत, अधिकांश कोशिकाओं में एमटीडीएनए की कई और प्रतियां होती हैं, जो सेल प्रकार के आधार पर 100 से कम से लेकर 200,000 से अधिक प्रतियां होती हैं। एमटीडीएनए कॉपी नंबर का उपयोग उम्र से संबंधित कई अपक्षयी स्थितियों और बीमारियों के लिए बायोमार्कर के रूप में तेजी से किया जाता है, और इस प्रकार, एमटीडीएनए कॉपी नंबर का सटीक माप अनुसंधान और नैदानिक सेटिंग्स दोनों में एक महत्वपूर्ण उपकरण बन रहा है। एमटीडीएनए में उत्परिवर्तन, जो अक्सर एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता (एसएनपी) या विलोपन के रूप में होता है, या तो सेल के भीतर एमटीडीएनए की सभी प्रतियों में मौजूद हो सकता है (जिसे होमोप्लाज्मी कहा जाता है) या उत्परिवर्तित और डब्ल्यूटी एमटीडीएनए प्रतियों (जिसे हेटेरोप्लाज्मी कहा जाता है) के मिश्रण के रूप में। हेटेरोप्लाज्मिक एमटीडीएनए उत्परिवर्तन नैदानिक माइटोकॉन्ड्रियल विकृति का एक प्रमुख कारण है, या तो दुर्लभ बीमारियों में या पार्किंसंस रोग जैसे आम देर से शुरू होने वाली बीमारियों की बढ़ती संख्या में। कोशिकाओं में मौजूद हेटरप्लाज्मी के स्तर का निर्धारण दुर्लभ माइटोकॉन्ड्रियल रोगों के निदान में और अनुसंधान में एक महत्वपूर्ण कदम है जिसका उद्देश्य आम देर से शुरू होने वाले विकारों को समझना है जहां माइटोकॉन्ड्रिया एक भूमिका निभा सकते हैं। एमटीडीएनए कॉपी नंबर और हेटेरोप्लाज्मी को पारंपरिक रूप से मात्रात्मक (क्यू) पीसीआर-आधारित परख या गहरी अनुक्रमण द्वारा मापा गया है। हालांकि, डीडीपीसीआर तकनीक की हालिया शुरूआत ने दोनों मापदंडों को मापने के लिए एक वैकल्पिक विधि प्रदान की है। यह मौजूदा तरीकों पर कई फायदे प्रदान करता है, जिसमें पूर्ण एमटीडीएनए कॉपी संख्या को मापने की क्षमता और कम कॉपी संख्या पर भी एकल कोशिकाओं से सटीक माप करने के लिए पर्याप्त संवेदनशीलता शामिल है। यहां प्रस्तुत एक विस्तृत प्रोटोकॉल है जो डीडीपीसीआर का उपयोग करके एकल कोशिकाओं में एमटीडीएनए कॉपी नंबर के माप का वर्णन करता है, जिसे ड्रॉपलेट जनरेशन पीसीआर के रूप में जाना जाता है, जिसमें एमटीडीएनए विलोपन के साथ कोशिकाओं में हेटेरोप्लाज्मी के एक साथ माप के लिए विकल्प है। एमटीडीएनए एसएनपी के साथ कोशिकाओं में हेटरोप्लाज्मी को मापने के लिए इस विधि का विस्तार करने की संभावना पर भी चर्चा की गई है।
स्तनधारी माइटोकॉन्ड्रियल (एमटी) डीएनए माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स में रहने वाला एक छोटा (लगभग 16.5 केबी), गोलाकार डीएनए जीनोम है जो 37 जीनों को एन्कोड करता है, जिसमें दो आरआरएनए, 22 टीआरएनए और 13 प्रोटीन-कोडिंग जीनशामिल हैं। परमाणु जीनोम के विपरीत, जिसमें प्रति कोशिका प्रत्येक जीन की एक (अगुणित) या दो (द्विगुणित) प्रतियां होती हैं, एमटीडीएनए प्रत्येक कोशिका के माइटोकॉन्ड्रिया में कई प्रतियों में मौजूद होता है, जो दसियों प्रतियों (जैसे, परिपक्व शुक्राणुकोशिकाओं) से लेकर सैकड़ों हजारों प्रतियों (जैसे, अंडाणुओं) तक होता है। इस बहु-प्रतिलिपि प्रकृति का एक परिणाम यह है कि एमटीडीएनए जीनोम में उ....
यहां वर्णित प्रोटोकॉल ऊपर चर्चा किए गए लोगों के अलावा सेल प्रकारों और प्रजातियों की एक विस्तृत श्रृंखला में लागू होता है, हालांकि नए परख डिजाइनों का सावधानीपूर्वक अनुकूलन यह सुनिश्चित करने के लिए मह?.......
ड्रॉपलेट जनरेशन पीसीआर डेटा के सांख्यिकीय विश्लेषण पर सलाह के लिए डॉ एल बोज़िलोवा को धन्यवाद। चित्रा 3 सी और चित्रा 4 बी में डेटा उत्पन्न करने के लिए उपयोग किए जाने वाले अंडाणुओं को प्रदान करने के लिए डॉ एच झांग को धन्यवाद। यह काम कैम्ब्रिज विश्वविद्यालय के मेडिकल रिसर्च काउंसिल माइटोकॉन्ड्रियल बायोलॉजी यूनिट (MC_UU_00015/9) में एसपीबी द्वारा किया गया था, और पीएफसी (212219 / जेड / 18 / जेड) द्वारा आयोजित वेलकम ट्रस्ट प्रिंसिपल रिसर्च फैलोशिप द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
50% Tween-20 solution | Novex | 3005 | |
Automated droplet-generating oil | Bio Rad | 1864110 | Commercial oil formulation used to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.1) |
C1000 PCR machine with deep-well block | Bio Rad | 1851197 | PCR thermocycler equipped with a deep-well heating block, used for cell lysis (Protocol Step 2.1.2.) and PCR cycling (Protocol Step 5) |
Collection plate cooling block | Bio Rad | 12002819 | Cooling block that keeps samples chilled during droplet generation (used in Protocol step 4.3) |
ddPCR 96-well plates | Bio Rad | 12001925 | 96-well plates pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator, used for sample preparation (Protocol step 3.4) and droplet collection (Protocol step 4.3) |
ddPCR droplet reader oil | Bio Rad | 1863004 | Commercial oil formulation used by the droplet reader (used in Protocol step 6.1) |
ddPCR Supermix for Probes (no dUTP) | Bio Rad | 1863023 | Commercial supermix for use in ddPCR experiments utilising probes (used in Protocol Step 3.3) |
DG32 automated droplet generator cartridges | Bio Rad | 1864108 | Microfluidic cartridges used in the QX200 AutoDG droplet generator to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.3) |
Fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | Qualified fetal bovine serum |
Foil plate covers | Bio Rad | 1814040 | Foil plate covers used to seal droplet collection plates after droplet generation (used in Protocol step 4.6) |
HEK 293T cells | Takara | 632180 | Commercial subclone of the transformed human embryonic kidney cell line, HEK 293, expressing the SV40 Large-T antigen |
HeLa cells | ECACC | 93021013 | Human cervix epitheloid carcinoma cells |
High glucose DMEM | Gibco | 13345364 | 4.5g/L D-Glucose, with L-glutamine and sodium pyruvate |
Human cybrids | University of Miami | ||
Mouse embryonic fibroblasts | Newcastle University | Immortalized from C57Bl/6 mice | |
Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | |
PCR plate seals | Pierce | SP-0027 | Clear adhesive plate seals, only used pre-droplet generation (foil seal must be used in step 4.6) |
Pipet Tip Waste Bins | Bio Rad | 1864125 | Disposable collection bin used to collect discarded tips in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3) |
Pipet tips for AutoDG system | Bio Rad | 1864120 | Filtered pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3) |
Primary human dermal fibroblast cells | Newcastle Biobank | ||
Primers/Probes | IDT | N/A | Exact primer/probe sequences will be assay dependent. Primers and probes used in this study are given in Table 1 |
Proteinase K 20 mg/mL solution | Ambion | AM2546 | |
PX1 PCR plate sealer | Bio Rad | 1814000 | Applies foil seals to ddPCR sample plates after droplet generation (used in Protocol Step 4.6) |
QX Manager software | Bio Rad | 12012172 | Droplet reader set up & analysis software (used in Protocol Steps 6 & 7) |
QX200 AutoDG droplet generator | Bio Rad | 1864101 | Automated microfluidic droplet generator (used in Protocol Step 4) |
QX200 droplet reader | Bio Rad | 1864003 | Droplet reader (used in Protocol Step 6) |
Trizma pre-set crystals pH 8.3 | Sigma | T8943-100G |
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