Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Medicine
여기에서는 단일 세포에서 절대 미토콘드리아(mt)DNA 복제 수와 mtDNA 결실 이형질 수준을 측정하기 위한 프로토콜을 제시합니다.
포유류 미토콘드리아 (mt) DNA는 전자 수송 사슬의 13 개 서브 유닛을 암호화하는 작고 원형의 이중 가닥 미토콘드리아 내 DNA 분자입니다. 이배체 핵 게놈과 달리 대부분의 세포에는 세포 유형에 따라 100개 미만에서 200,000개 이상의 사본에 이르는 mtDNA 사본이 더 많이 포함되어 있습니다. MtDNA 복제 수는 여러 연령 관련 퇴행성 질환 및 질병에 대한 바이오마커로 점점 더 많이 사용되고 있으며, 따라서 mtDNA 복제 수의 정확한 측정은 연구 및 진단 환경 모두에서 핵심 도구가 되고 있습니다. 종종 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP) 또는 결실로 발생하는 mtDNA의 돌연변이는 세포 내 mtDNA의 모든 사본 (동형 플라즘이라고 함) 또는 돌연변이 및 WT mtDNA 사본의 혼합물 (이종 플라스미라고 함)로 존재할 수 있습니다. 이종질 mtDNA 돌연변이는 희귀 질환 또는 파킨슨병과 같은 점점 더 많은 일반적인 후기 발병 질환에서 임상 미토콘드리아 병리의 주요 원인입니다. 세포에 존재하는 이형질의 수준을 결정하는 것은 희귀 미토콘드리아 질환의 진단과 미토콘드리아가 역할을 할 수있는 일반적인 후기 발병 장애를 이해하기위한 연구에서 중요한 단계입니다. MtDNA 복제 수 및 이형질은 전통적으로 정량적 (q) PCR 기반 분석 또는 심층 시퀀싱에 의해 측정되었습니다. 그러나 최근 도입된 ddPCR 기술은 두 파라미터를 모두 측정하기 위한 대체 방법을 제공했습니다. 절대 mtDNA 복제 수를 측정할 수 있는 기능과 낮은 복제 수에서도 단일 세포에서 정확한 측정을 수행할 수 있는 충분한 감도를 포함하여 기존 방법에 비해 몇 가지 이점을 제공합니다. 여기에 제시된 것은 ddPCR을 사용하여 단일 세포에서 mtDNA 복제 수의 측정을 설명하는 자세한 프로토콜이며, 이후 액적 생성 PCR이라고 하며, mtDNA가 결실된 세포에서 이형질을 동시에 측정하는 옵션이 있습니다. mtDNA SNP를 가진 세포에서 이형질을 측정하기 위해이 방법을 확장 할 가능성도 논의된다.
포유류 미토콘드리아(mt)DNA는 2개의 rRNA, 22개의 tRNA 및 13개의 단백질 코딩 유전자로 구성된 37개의 유전자를 암호화하는 미토콘드리아 매트릭스에 상주하는 작은(약 16.5Kb) 원형 DNA게놈입니다. 세포당 각 유전자의 사본이 하나(반수체) 또는 두 개(이배체) 복제를 포함하는 핵 게놈과 달리 mtDNA는 각 세포의 미토콘드리아에 수십 개의 사본(예: 성숙한 정자세포)에서 수십만 개의 사본(예: 난모세포)에 이르기까지 여러 사본으로 존재합니다2,3. 이러한 다중 복제 특성의 결과는 단일 염기 다형성(SNP), 결실 또는 복제로 존재할 수 있는 mtDNA 게놈의 돌연변이가 주어진 세포에서 다양한 수준으로 존재할 수 있으며 세포의 전체 mtDNA 집단의 0%에서 100%까지 구성할 수 있다는 것입니다. 동일한 세포에 야생형 및 돌연변이 mtDNA 게놈이 존재하는 것을 이형질이라고 하며, 병원성 이형질 mtDNA 돌연변이는 미토콘드리아 질환의 주요 원인이며, 몇 가지 일반적인 신경 증후군이 근본적인 이형질 mtDNA 돌연변이와관련이 있습니다4.
모든 실험은 REACH 지침을 따랐으며 캠브리지 대학 동물 복지 윤리 검토 기관 (AWERB)의 승인을 받았습니다.
알림: 액적 생성 전 모든 샘플 준비 단계는 깨끗한 사전 PCR 작업 영역, 가능하면 UV 멸균 캐비닛에서 수행해야 합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 특정 액적 생성 PCR 장비( 재료 표 참조)를 사용하며, 일반적인 방법은 다른 시스템에도 적용할 수 있어야 하지만 ?.......
액적 생성 후 불투명한 액적의 투명한 층이 각 웰의 오일 상 위에 떠 있는 것을 볼 수 있습니다(그림 1B). 액적 형성은 단일 세포에 대한 실험을 수행할 때 투입 용해물에 세제가 존재함으로써 악영향을 받을 수 있습니다. 2.1.2.에 설명된 용해 프로토콜을 사용하면 최종 샘플에 소량의 TWEEN-20이 존재함에도 불구하고 권장 수준인 10,000 이상의 액적 수율이 일상적으로 달성됩니다.......
여기에 설명된 프로토콜은 위에서 논의한 것 외에도 광범위한 세포 유형 및 종에 적용할 수 있지만, 이전에 검증된 프라이머/프로브 조합에서 벗어날 때 분석법의 정확성과 반복성이 유지되도록 하려면 새로운 분석 설계의 신중한 최적화가 중요합니다. 단일 세포로 작업할 때 샘플 수집이 가능한 한 정확하게 수행되도록 하고(예: FACS로 세포를 분류할 때 엄격한 단일 세포 파라미터 사용) 얻은 결?.......
액적 생성 PCR 데이터의 통계 분석에 대한 조언을 해주신 L Bozhilova 박사에게 감사드립니다. 그림 3C 및 그림 4B에서 데이터를 생성하는 데 사용되는 난모세포를 제공한 H Zhang 박사에게 감사드립니다. 이 작업은 캠브리지 대학의 의학 연구위원회 미토콘드리아 생물학 단위 (MC_UU_00015 / 9)의 SPB에 의해 수행되었으며 PFC (212219 / Z / 18 / Z)가 보유한 Wellcome Trust Principal Research Fellowship의 자금 지원을 받았습니다.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
50% Tween-20 solution | Novex | 3005 | |
Automated droplet-generating oil | Bio Rad | 1864110 | Commercial oil formulation used to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.1) |
C1000 PCR machine with deep-well block | Bio Rad | 1851197 | PCR thermocycler equipped with a deep-well heating block, used for cell lysis (Protocol Step 2.1.2.) and PCR cycling (Protocol Step 5) |
Collection plate cooling block | Bio Rad | 12002819 | Cooling block that keeps samples chilled during droplet generation (used in Protocol step 4.3) |
ddPCR 96-well plates | Bio Rad | 12001925 | 96-well plates pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator, used for sample preparation (Protocol step 3.4) and droplet collection (Protocol step 4.3) |
ddPCR droplet reader oil | Bio Rad | 1863004 | Commercial oil formulation used by the droplet reader (used in Protocol step 6.1) |
ddPCR Supermix for Probes (no dUTP) | Bio Rad | 1863023 | Commercial supermix for use in ddPCR experiments utilising probes (used in Protocol Step 3.3) |
DG32 automated droplet generator cartridges | Bio Rad | 1864108 | Microfluidic cartridges used in the QX200 AutoDG droplet generator to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.3) |
Fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | Qualified fetal bovine serum |
Foil plate covers | Bio Rad | 1814040 | Foil plate covers used to seal droplet collection plates after droplet generation (used in Protocol step 4.6) |
HEK 293T cells | Takara | 632180 | Commercial subclone of the transformed human embryonic kidney cell line, HEK 293, expressing the SV40 Large-T antigen |
HeLa cells | ECACC | 93021013 | Human cervix epitheloid carcinoma cells |
High glucose DMEM | Gibco | 13345364 | 4.5g/L D-Glucose, with L-glutamine and sodium pyruvate |
Human cybrids | University of Miami | ||
Mouse embryonic fibroblasts | Newcastle University | Immortalized from C57Bl/6 mice | |
Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | |
PCR plate seals | Pierce | SP-0027 | Clear adhesive plate seals, only used pre-droplet generation (foil seal must be used in step 4.6) |
Pipet Tip Waste Bins | Bio Rad | 1864125 | Disposable collection bin used to collect discarded tips in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3) |
Pipet tips for AutoDG system | Bio Rad | 1864120 | Filtered pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3) |
Primary human dermal fibroblast cells | Newcastle Biobank | ||
Primers/Probes | IDT | N/A | Exact primer/probe sequences will be assay dependent. Primers and probes used in this study are given in Table 1 |
Proteinase K 20 mg/mL solution | Ambion | AM2546 | |
PX1 PCR plate sealer | Bio Rad | 1814000 | Applies foil seals to ddPCR sample plates after droplet generation (used in Protocol Step 4.6) |
QX Manager software | Bio Rad | 12012172 | Droplet reader set up & analysis software (used in Protocol Steps 6 & 7) |
QX200 AutoDG droplet generator | Bio Rad | 1864101 | Automated microfluidic droplet generator (used in Protocol Step 4) |
QX200 droplet reader | Bio Rad | 1864003 | Droplet reader (used in Protocol Step 6) |
Trizma pre-set crystals pH 8.3 | Sigma | T8943-100G |
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