Måling av enkeltcellet mitokondrielt DNA-kopinummer og heteroplasmi ved bruk av digital dråpepolymerasekjedereaksjon

Her presenterer vi en protokoll for måling av absolutt mitokondrielt (mt)DNA-kopinummer og mtDNA-sletting heteroplasminivå i enkeltceller.

Pattedyrets mitokondrielle (mt) DNA er et lite, sirkulært, dobbeltstrenget, intra-mitokondrielt DNA-molekyl, som koder for 13 underenheter av elektrontransportkjeden. I motsetning til det diploide nukleære genomet inneholder de fleste celler mange flere kopier av mtDNA, alt fra mindre enn 100 til over 200 000 kopier, avhengig av celletype. MtDNA-kopinummer brukes i økende grad som biomarkør for en rekke aldersrelaterte degenerative tilstander og sykdommer, og dermed blir nøyaktig måling av mtDNA-kopinummeret et sentralt verktøy i både forsknings- og diagnostiske innstillinger. Mutasjoner i mtDNA, som ofte forekommer som enkeltnukleotidpolymorfismer (SNPs) eller delesjoner, kan enten eksistere i alle kopier av mtDNA i cellen (betegnet homoplasmi) eller som en blanding av muterte og WT mtDNA-kopier (kalt heteroplasmi). Heteroplasmatiske mtDNA-mutasjoner er en viktig årsak til klinisk mitokondriell patologi, enten i sjeldne sykdommer eller i et økende antall vanlige sent debuterende sykdommer som Parkinsons sykdom. Å bestemme nivået av heteroplasmi tilstede i celler er et kritisk skritt i diagnosen sjeldne mitokondrielle sykdommer og i forskning som tar sikte på å forstå vanlige senstartsforstyrrelser der mitokondrier kan spille en rolle. MtDNA-kopinummer og heteroplasmi har tradisjonelt blitt målt ved kvantitative (q) PCR-baserte analyser eller dypsekvensering. Den nylige introduksjonen av ddPCR-teknologi har imidlertid gitt en alternativ metode for å måle begge parametrene. Det gir flere fordeler i forhold til eksisterende metoder, inkludert muligheten til å måle absolutt mtDNA-kopinummer og tilstrekkelig følsomhet for å gjøre nøyaktige målinger fra enkeltceller selv ved lave kopinumre. Her presenteres en detaljert protokoll som beskriver måling av mtDNA-kopinummer i enkeltceller ved bruk av ddPCR, referert til som dråpegenerering PCR fremover, med mulighet for samtidig måling av heteroplasmi i celler med mtDNA-delesjoner. Muligheten for å utvide denne metoden for å måle heteroplasmi i celler med mtDNA SNPs diskuteres også.

Pattedyrs mitokondrielle (mt) DNA er et lite (ca. 16,5 Kb), sirkulært DNA-genom som ligger i mitokondriell matrise som koder for 37 gener, bestående av to rRNA, 22 tRNA og 13 proteinkodende gener¹. I motsetning til det nukleære genomet, som inneholder en (haploid) eller to (diploide) kopier av hvert gen per celle, er mtDNA tilstede i flere kopier i mitokondriene til hver celle, alt fra titalls kopier (f.eks. Modne spermatocytter) til hundretusener av kopier (f.eks. Oocytter)^2,3. En konsekvens av denne multikopi-naturen er at mutasjoner i mtDNA-genomet, som kan eksistere som enkeltnukleo....

Alle forsøkene fulgte ARRIVE-retningslinjene og ble godkjent av University of Cambridge Animal Welfare Ethical Review Body (AWERB).

MERK: Alle prøveprepareringstrinn før dråpegenerering må utføres i et rent arbeidsområde før PCR, ideelt i et UV-sterilisert skap der det er mulig. Protokollen som er beskrevet her, bruker spesifikt PCR-utstyr for dråpegenerering (se materialfortegnelse), og selv om den generelle metoden skal gjelde for andre systemer, anbefales det å ko.......

Etter dråpegenerering er det synlig et klart lag med ugjennomsiktige dråper som flyter oppå oljefasen i hver brønn (figur 1B). Dråpedannelse kan påvirkes negativt av tilstedeværelsen av vaskemidler i inngangslysatet når man utfører eksperimenter på enkeltceller. Ved bruk av lysisprotokollen beskrevet i 2.1.2., oppnås rutinemessig dråpeutbytter over anbefalt nivå på 10 000, til tross for at det foreligger en liten restmengde TWEEN-20 i den endelige prøven (.......

Protokollen beskrevet her er anvendelig over et bredt spekter av celletyper og arter i tillegg til de som er diskutert ovenfor, selv om nøye optimalisering av nye analysedesign vil være nøkkelen for å sikre at nøyaktigheten og repeterbarheten av metoden opprettholdes når du beveger deg bort fra tidligere validerte primer / sondekombinasjoner. Når du arbeider med enkeltceller, er det viktig å sikre at prøveinnsamlingen utføres så nøyaktig som mulig (f.eks. Ved bruk av strenge enkeltcelleparametere ved sorterin.......

Takk til Dr. L Bozhilova for råd om statistisk analyse av dråpegenerering PCR-data. Takk til Dr. H Zhang for å gi oocytter som brukes til å generere data i figur 3C og figur 4B. Dette arbeidet ble utført av SPB ved Medical Research Council Mitochondrial Biology Unit (MC_UU_00015/9), University of Cambridge, og finansiert av et Wellcome Trust Principal Research Fellowship holdt av PFC (212219 / Z / 18 / Z).