Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Medicine
Здесь мы представляем протокол измерения абсолютного числа копий митохондриальной (мт)ДНК и уровней гетероплазмы делеции мтДНК в отдельных клетках.
Митохондриальная (мт)ДНК млекопитающих представляет собой небольшую, круглую, двухцепочечную, внутримитохондриальную молекулу ДНК, кодирующую 13 субъединиц электронной транспортной цепи. В отличие от диплоидного ядерного генома, большинство клеток содержат гораздо больше копий мтДНК, от менее 100 до более чем 200 000 копий в зависимости от типа клетки. Число копий мтДНК все чаще используется в качестве биомаркера для ряда возрастных дегенеративных состояний и заболеваний, и, таким образом, точное измерение числа копий мтДНК становится ключевым инструментом как в исследовательских, так и в диагностических условиях. Мутации в мтДНК, часто встречающиеся в виде однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) или делеций, могут либо существовать во всех копиях мтДНК в клетке (называемые гомоплазмой), либо в виде смеси мутированных и WT-копий мтДНК (называемых гетероплазмой). Гетероплазматические мутации мтДНК являются основной причиной клинической митохондриальной патологии, либо при редких заболеваниях, либо при растущем числе распространенных заболеваний с поздним началом, таких как болезнь Паркинсона. Определение уровня гетероплазмы, присутствующей в клетках, является критическим шагом в диагностике редких митохондриальных заболеваний и в исследованиях, направленных на понимание распространенных поздних расстройств, где митохондрии могут играть определенную роль. Число копий мтДНК и гетероплазма традиционно измерялись с помощью количественных (q)ПЦР-анализов или глубокого секвенирования. Однако недавнее внедрение технологии ddPCR обеспечило альтернативный метод измерения обоих параметров. Он предлагает несколько преимуществ по сравнению с существующими методами, включая возможность измерения абсолютного числа копий мтДНК и достаточную чувствительность для проведения точных измерений из отдельных ячеек даже при низких числах копий. Здесь представлен подробный протокол, описывающий измерение числа копий мтДНК в отдельных клетках с использованием ddPCR, впредь называемой ПЦР капельной генерации, с возможностью одновременного измерения гетероплазмы в клетках с делециями мтДНК. Также обсуждается возможность расширения этого метода для измерения гетероплазмы в клетках с мтДНК SNP.
Митохондриальная (мт)ДНК млекопитающих представляет собой небольшой (около 16,5 Кб) круговой геном ДНК, находящийся в митохондриальной матрице, которая кодирует 37 генов, включающих две рРНК, 22 тРНК и 13 генов, кодирующих белки1. В отличие от ядерного генома, который содержит одну (гаплоидную) или две (диплоидные) копии каждого гена на клетку, мтДНК присутствует в нескольких копиях в митохондриях каждой клетки, начиная от десятков копий (например, зрелых сперматоцитов) до сотен тысяч копий (например, ооцитов)2,3. Следствием этой многокопийной природы является то, что мутации в геноме м....
Все эксперименты соответствовали рекомендациям ARRIVE и были одобрены Этическим обзорным органом благосостояния животных Кембриджского университета (AWERB).
ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы пробоподготовки до образования капель должны выполняться в чистой рабочей зоне перед ПЦР, в ид.......
После генерации капель виден прозрачный слой непрозрачных капель, плавающих поверх нефтяной фазы в каждой скважине (рисунок 1B). На образование капель может негативно повлиять наличие моющих средств во входном лизате при проведении экспериментов на одиночных клетках. И.......
Протокол, описанный здесь, применим к широкому кругу типов клеток и видов в дополнение к тем, которые обсуждались выше, хотя тщательная оптимизация новых конструкций анализов будет иметь ключевое значение для обеспечения точности и повторяемости метода при отходе от ранее проверенных.......
Благодарим доктора Л. Божилову за советы по статистическому анализу данных ПЦР капельной генерации. Спасибо доктору Х. Чжану за предоставление ооцитов, используемых для генерации данных на рисунках 3C и 4B. Эта работа была выполнена SPB в Отделе митохондриальной биологии Совета по медицинским исследованиям (MC_UU_00015/9 Кембриджского университета и финансировалась Главной исследовательской стипендией Wellcome Trust, проводимой PFC (212219/ Z / 18 / Z).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
50% Tween-20 solution | Novex | 3005 | |
Automated droplet-generating oil | Bio Rad | 1864110 | Commercial oil formulation used to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.1) |
C1000 PCR machine with deep-well block | Bio Rad | 1851197 | PCR thermocycler equipped with a deep-well heating block, used for cell lysis (Protocol Step 2.1.2.) and PCR cycling (Protocol Step 5) |
Collection plate cooling block | Bio Rad | 12002819 | Cooling block that keeps samples chilled during droplet generation (used in Protocol step 4.3) |
ddPCR 96-well plates | Bio Rad | 12001925 | 96-well plates pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator, used for sample preparation (Protocol step 3.4) and droplet collection (Protocol step 4.3) |
ddPCR droplet reader oil | Bio Rad | 1863004 | Commercial oil formulation used by the droplet reader (used in Protocol step 6.1) |
ddPCR Supermix for Probes (no dUTP) | Bio Rad | 1863023 | Commercial supermix for use in ddPCR experiments utilising probes (used in Protocol Step 3.3) |
DG32 automated droplet generator cartridges | Bio Rad | 1864108 | Microfluidic cartridges used in the QX200 AutoDG droplet generator to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.3) |
Fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | Qualified fetal bovine serum |
Foil plate covers | Bio Rad | 1814040 | Foil plate covers used to seal droplet collection plates after droplet generation (used in Protocol step 4.6) |
HEK 293T cells | Takara | 632180 | Commercial subclone of the transformed human embryonic kidney cell line, HEK 293, expressing the SV40 Large-T antigen |
HeLa cells | ECACC | 93021013 | Human cervix epitheloid carcinoma cells |
High glucose DMEM | Gibco | 13345364 | 4.5g/L D-Glucose, with L-glutamine and sodium pyruvate |
Human cybrids | University of Miami | ||
Mouse embryonic fibroblasts | Newcastle University | Immortalized from C57Bl/6 mice | |
Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | |
PCR plate seals | Pierce | SP-0027 | Clear adhesive plate seals, only used pre-droplet generation (foil seal must be used in step 4.6) |
Pipet Tip Waste Bins | Bio Rad | 1864125 | Disposable collection bin used to collect discarded tips in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3) |
Pipet tips for AutoDG system | Bio Rad | 1864120 | Filtered pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3) |
Primary human dermal fibroblast cells | Newcastle Biobank | ||
Primers/Probes | IDT | N/A | Exact primer/probe sequences will be assay dependent. Primers and probes used in this study are given in Table 1 |
Proteinase K 20 mg/mL solution | Ambion | AM2546 | |
PX1 PCR plate sealer | Bio Rad | 1814000 | Applies foil seals to ddPCR sample plates after droplet generation (used in Protocol Step 4.6) |
QX Manager software | Bio Rad | 12012172 | Droplet reader set up & analysis software (used in Protocol Steps 6 & 7) |
QX200 AutoDG droplet generator | Bio Rad | 1864101 | Automated microfluidic droplet generator (used in Protocol Step 4) |
QX200 droplet reader | Bio Rad | 1864003 | Droplet reader (used in Protocol Step 6) |
Trizma pre-set crystals pH 8.3 | Sigma | T8943-100G |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved