Mätning av encells mitokondriellt DNA-kopieringsnummer och heteroplasmi med hjälp av digital dropppolymeraskedjereaktion

Här presenterar vi ett protokoll för mätning av absolut mitokondriellt (mt)DNA-kopieringsnummer och mtDNA-deletion heteroplasminivåer i enskilda celler.

Däggdjurens mitokondriella (mt) DNA är en liten, cirkulär, dubbelsträngad, intra-mitokondriell DNA-molekyl som kodar för 13 underenheter i elektrontransportkedjan. Till skillnad från det diploida kärngenomet innehåller de flesta celler många fler kopior av mtDNA, allt från mindre än 100 till över 200 000 kopior beroende på celltyp. MtDNA-kopieringsnummer används alltmer som en biomarkör för ett antal åldersrelaterade degenerativa tillstånd och sjukdomar, och därmed blir noggrann mätning av mtDNA-kopieringsnumret ett viktigt verktyg i både forsknings- och diagnostikinställningar. Mutationer i mtDNA, som ofta förekommer som enstaka nukleotidpolymorfismer (SNP) eller deletioner, kan antingen existera i alla kopior av mtDNA i cellen (kallad homoplasmi) eller som en blandning av muterade och WT mtDNA-kopior (kallad heteroplasmi). Heteroplasmiska mtDNA-mutationer är en viktig orsak till klinisk mitokondriell patologi, antingen i sällsynta sjukdomar eller i ett växande antal vanliga sena sjukdomar som Parkinsons sjukdom. Att bestämma nivån av heteroplasmi som finns i celler är ett kritiskt steg i diagnosen av sällsynta mitokondriella sjukdomar och i forskning som syftar till att förstå vanliga sena störningar där mitokondrier kan spela en roll. MtDNA-kopieringsnummer och heteroplasmi har traditionellt mätts med kvantitativa (q) PCR-baserade analyser eller djup sekvensering. Den senaste introduktionen av ddPCR-teknik har dock gett en alternativ metod för att mäta båda parametrarna. Det erbjuder flera fördelar jämfört med befintliga metoder, inklusive möjligheten att mäta absolut mtDNA-kopieringsnummer och tillräcklig känslighet för att göra exakta mätningar från enskilda celler även vid låga kopieringsnummer. Här presenteras ett detaljerat protokoll som beskriver mätningen av mtDNA-kopieringsnummer i enskilda celler med ddPCR, hädanefter kallad droppgenerering PCR, med möjlighet till samtidig mätning av heteroplasmi i celler med mtDNA-deletioner. Möjligheten att utvidga denna metod för att mäta heteroplasmi i celler med mtDNA SNP diskuteras också.

Mitokondriellt (mt) DNA från däggdjur är ett litet (ca 16,5 Kb), cirkulärt DNA-genom som finns i mitokondriell matris som kodar för 37 gener, bestående av två rRNA, 22 tRNA och 13 proteinkodande gener¹. Till skillnad från kärngenomet, som innehåller en (haploid) eller två (diploida) kopior av varje gen per cell, finns mtDNA i flera kopior i mitokondrierna i varje cell, allt från tiotals kopior (t.ex. mogna spermatocyter) till hundratusentals kopior (t.ex. oocyter)^2,3. En konsekvens av denna multi-copy natur är att mutationer i mtDNA-genomet, som kan existera som en-nukleotidpolymorfisme....

Alla experiment följde ARRIVE-riktlinjerna och godkändes av University of Cambridge Animal Welfare Ethical Review Body (AWERB).

OBS: Alla provberedningssteg före droppgenerering måste utföras i ett rent arbetsområde före PCR, helst i ett UV-steriliserat skåp där det är möjligt. Protokollet som beskrivs här använder specifik PCR-utrustning för droppgenerering (se materialförteckning), och även om den allmänna metoden bör vara tillämplig på andra system, reko.......

Efter droppgenerering syns ett tydligt lager av ogenomskinliga droppar flyta ovanpå oljefasen i varje brunn (figur 1B). Droppbildning kan påverkas negativt av närvaron av tvättmedel i ingångslysatet vid experiment på enstaka celler. Med hjälp av lysprotokollet som beskrivs i 2.1.2 uppnås dropputbyten över den rekommenderade nivån på 10 000 rutinmässigt, trots att det finns en liten restmängd av TWEEN-20 i det slutliga provet (figur 1C). Men med andr.......

Protokollet som beskrivs här är tillämpligt på ett brett spektrum av celltyper och arter utöver de som diskuterats ovan, även om noggrann optimering av nya analysdesigner kommer att vara nyckeln till att säkerställa att metodens noggrannhet och repeterbarhet bibehålls när man går bort från tidigare validerade primer / sondkombinationer. Vid arbete med enstaka celler är det viktigt att se till att provtagningen utförs så exakt som möjligt (t.ex. med hjälp av stränga encellsparametrar vid sortering av cel.......

Tack till Dr. L Bozhilova för råd om statistisk analys av droppgenerering PCR-data. Tack till Dr. H Zhang för att tillhandahålla de oocyter som används för att generera data i figur 3C och figur 4B. Detta arbete utfördes av SPB vid Medical Research Council Mitochondrial Biology Unit (MC_UU_00015/9), University of Cambridge, och finansierades av ett Wellcome Trust Principal Research Fellowship som innehas av PFC (212219/Z/18/Z).