JoVE Logo
Faculty Resource Center
Authors
Librarians
High Schools
About

Sign In

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Acknowledgements

Materials

References

Medicine

Dijital Damlacık Polimeraz Zincir Reaksiyonu Kullanarak Tek Hücreli Mitokondriyal DNA Kopya Sayısını ve Heteroplazmiyi Ölçme

Published: July 12th, 2022

DOI:

10.3791/63870

1Department of Clinical Neurosciences, School of Clinical Medicine, University of Cambridge, Cambridge Biomedical Campus, 2Medical Research Council Mitochondrial Biology Unit, University of Cambridge, Cambridge Biomedical Campus

Burada, tek hücrelerde mutlak mitokondriyal (mt) DNA kopya sayısını ve mtDNA delesyon heteroplazmi seviyelerini ölçmek için bir protokol sunuyoruz.

Memeli mitokondriyal (mt) DNA'sı, elektron taşıma zincirinin 13 alt birimini kodlayan küçük, dairesel, çift sarmallı, mitokondriyal bir DNA molekülüdür. Diploid nükleer genomun aksine, çoğu hücre, hücre tipine bağlı olarak 100'den az ila 200.000'den fazla kopya arasında değişen mtDNA'nın çok daha fazla kopyasını içerir. MtDNA kopya sayısı, yaşa bağlı bir dizi dejeneratif durum ve hastalık için bir biyobelirteç olarak giderek daha fazla kullanılmaktadır ve bu nedenle, mtDNA kopya sayısının doğru ölçümü hem araştırma hem de teşhis ortamlarında önemli bir araç haline gelmektedir. Genellikle tek nükleotid polimorfizmleri (SNP'ler) veya delesyonlar olarak ortaya çıkan mtDNA'daki mutasyonlar, hücre içindeki mtDNA'nın tüm kopyalarında (homoplazmi olarak adlandırılır) veya mutasyona uğramış ve WT mtDNA kopyalarının (heteroplazmi olarak adlandırılır) bir karışımı olarak bulunabilir. Heteroplazmik mtDNA mutasyonları, nadir hastalıklarda veya Parkinson hastalığı gibi giderek artan sayıda yaygın geç başlangıçlı hastalıkta klinik mitokondriyal patolojinin önemli bir nedenidir. Hücrelerde bulunan heteroplazmi seviyesinin belirlenmesi, nadir görülen mitokondriyal hastalıkların tanısında ve mitokondrinin rol oynayabileceği yaygın geç başlangıçlı bozuklukları anlamayı amaçlayan araştırmalarda kritik bir adımdır. MtDNA kopya sayısı ve heteroplazmi geleneksel olarak kantitatif (q) PCR tabanlı testler veya derin dizileme ile ölçülmüştür. Bununla birlikte, ddPCR teknolojisinin yakın zamanda tanıtılması, her iki parametreyi ölçmek için alternatif bir yöntem sağlamıştır. Mutlak mtDNA kopya sayısını ölçme yeteneği ve düşük kopya sayılarında bile tek hücrelerden doğru ölçümler yapmak için yeterli hassasiyet de dahil olmak üzere mevcut yöntemlere göre çeşitli avantajlar sunar. Burada, ddPCR kullanılarak tek hücrelerde mtDNA kopya sayısının ölçümünü açıklayan ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır, bundan böyle damlacık üretimi PCR olarak adlandırılacaktır ve mtDNA delesyonlu hücrelerde heteroplazmilerin eşzamanlı olarak ölçülmesi seçeneği sunulmaktadır. Bu yöntemin mtDNA SNP'li hücrelerde heteroplazmiyi ölçmek için genişletilmesi olasılığı da tartışılmaktadır.

Memeli mitokondriyal (mt) DNA'sı, iki rRNA, 22 tRNA ve 13 protein kodlayan gen 1'den oluşan 37 geni kodlayan mitokondriyal matriste bulunan küçük (yaklaşık 16.5 Kb), dairesel bir DNA genomudur. Hücre başına her genin bir (haploid) veya iki (diploid) kopyasını içeren nükleer genomun aksine, mtDNA, her hücrenin mitokondrisinde, onlarca kopyadan (örneğin, olgun spermatositler) yüz binlerce kopyaya (örneğin, oositler) kadar değişen çoklu kopyalarda bulunur2,3. Bu çok kopyalı doğanın bir sonucu, mtDNA genomundaki tek nükleotid polimorfizmleri (SNP'ler), delesyonlar veya duplikasyonlar olarak....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tüm deneyler ARRIVE yönergelerini takip etti ve Cambridge Üniversitesi Hayvan Refahı Etik İnceleme Organı (AWERB) tarafından onaylandı.

NOT: Damlacık oluşturmadan önceki tüm numune hazırlama adımları, temiz bir PCR öncesi çalışma alanında, ideal olarak mümkün olduğunda UV sterilize edilmiş bir kabinde gerçekleştirilmelidir. Burada açıklanan protokol, belirli damlacık üretimi PCR ekipmanı kullanır ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve genel yöntemin.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Damlacık oluşumunu takiben, her bir kuyucuktaki yağ fazının üstünde yüzen şeffaf bir opak damlacık tabakası görülebilir (Şekil 1B). Damlacık oluşumu, tek hücreler üzerinde deneyler yapılırken giriş lizatındaki deterjanların varlığından olumsuz etkilenebilir. 2.1.2.'de açıklanan lizis protokolü kullanılarak, son numunede küçük bir kalıntı miktarda TWEEN-20 bulunmasına rağmen, önerilen 10.000 seviyesinin üzerindeki damlacık verimleri rutin olarak elde ed.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Burada açıklanan protokol, yukarıda tartışılanlara ek olarak çok çeşitli hücre tipleri ve türleri arasında uygulanabilir, ancak yeni tahlil tasarımlarının dikkatli optimizasyonu, daha önce doğrulanmış primer / prob kombinasyonlarından uzaklaşırken yöntemin doğruluğunun ve tekrarlanabilirliğinin korunmasını sağlamak için anahtar olacaktır. Tek hücrelerle çalışırken, elde edilen sonuçların tek tek hücrelerinkileri gerçekten yansıttığından emin olmak için numune toplamanın mümk.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dr. L Bozhilova'ya damlacık üretimi PCR verilerinin istatistiksel analizi konusunda tavsiyeleriniz için teşekkür ederiz. Dr. H Zhang'a, Şekil 3C ve Şekil 4B'de veri üretmek için kullanılan oositleri sağladığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Cambridge Üniversitesi Tıbbi Araştırma Konseyi Mitokondriyal Biyoloji Birimi'nde (MC_UU_00015 / 9) SPB tarafından yürütülmüş ve PFC (212219 / Z / 18 / Z) tarafından düzenlenen Wellcome Trust Principal Research Fellowship tarafından finanse edilmiştir.

....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NameCompanyCatalog NumberComments
50% Tween-20 solutionNovex3005
Automated droplet-generating oil Bio Rad1864110Commercial oil formulation used to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.1)
C1000 PCR machine with deep-well blockBio Rad1851197PCR thermocycler equipped with a deep-well heating block, used for cell lysis (Protocol Step 2.1.2.) and PCR cycling (Protocol Step 5)
Collection plate cooling blockBio Rad12002819Cooling block that keeps samples chilled during droplet generation (used in Protocol step 4.3)
ddPCR 96-well plates Bio Rad1200192596-well plates pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator, used for sample preparation (Protocol step 3.4) and droplet collection (Protocol step 4.3)
ddPCR droplet reader oil Bio Rad1863004Commercial oil formulation used by the droplet reader (used in Protocol step 6.1)
ddPCR Supermix for Probes (no dUTP)Bio Rad1863023Commercial supermix for use in ddPCR experiments utilising probes (used in Protocol Step 3.3)
DG32 automated droplet generator cartridges Bio Rad1864108Microfluidic cartridges used in the QX200 AutoDG droplet generator to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.3)
Fetal bovine serumGibco10270-106Qualified fetal bovine serum
Foil plate covers Bio Rad1814040Foil plate covers used to seal droplet collection plates after droplet generation (used in Protocol step 4.6)
HEK 293T cellsTakara632180Commercial subclone of the transformed human embryonic kidney cell line, HEK 293, expressing the SV40 Large-T antigen
HeLa cellsECACC93021013Human cervix epitheloid carcinoma cells
High glucose DMEMGibco133453644.5g/L D-Glucose, with L-glutamine and sodium pyruvate
Human cybridsUniversity of Miami
Mouse embryonic fibroblasts Newcastle UniversityImmortalized from C57Bl/6 mice
Nuclease-free waterAmbionAM9937
PCR plate sealsPierceSP-0027Clear adhesive plate seals, only used pre-droplet generation (foil seal must be used in step 4.6)
Pipet Tip Waste BinsBio Rad1864125Disposable collection bin used to collect discarded tips in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3)
Pipet tips for AutoDG system Bio Rad1864120Filtered pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3)
Primary human dermal fibroblast cellsNewcastle Biobank
Primers/ProbesIDTN/AExact primer/probe sequences will be assay dependent. Primers and probes used in this study are given in Table 1
Proteinase K 20 mg/mL solutionAmbionAM2546
PX1 PCR plate sealerBio Rad1814000Applies foil seals to ddPCR sample plates after droplet generation (used in Protocol Step 4.6)
QX Manager softwareBio Rad12012172Droplet reader set up & analysis software (used in Protocol Steps 6 & 7)
QX200 AutoDG droplet generatorBio Rad1864101Automated microfluidic droplet generator (used in Protocol Step 4)
QX200 droplet readerBio Rad1864003Droplet reader (used in Protocol Step 6)
Trizma pre-set crystals pH 8.3SigmaT8943-100G

  1. Taanman, J. W. The mitochondrial genome: structure, transcription, translation and replication. Biochimica Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).
  2. Wai, T., et al. The role of mitochondrial DNA copy number in mammalian fertility. Biology of Reproduction. 83 (1), 52-62 (2010).
  3. D'Erchia, A. M., et al. Tissue-specific mtDNA abundance from exome data and its correlation with mitochondrial transcription, mass and respiratory activity. Mitochondrion. 20, 13-21 (2015).
  4. Stewart, J. B., Chinnery, P. F. The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: implications for human health and disease. Nature Reviews: Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).
  5. Durham, S. E., Samuels, D. C., Cree, L. M., Chinnery, P. F. Normal levels of wild-type mitochondrial DNA maintain cytochrome c oxidase activity for two pathogenic mitochondrial DNA mutations but not for m.3243A-->G. American Journal of Human Genetics. 81 (1), 189-195 (2007).
  6. Liu, H., et al. Wild-type mitochondrial DNA copy number in urinary cells as a useful marker for diagnosing severity of the mitochondrial diseases. PloS One. 8 (6), 67146 (2013).
  7. Filograna, R., et al. Modulation of mtDNA copy number ameliorates the pathological consequences of a heteroplasmic mtDNA mutation in the mouse. Science Advances. 5 (4), (2019).
  8. Wang, Y., et al. The increase of mitochondrial DNA content in endometrial adenocarcinoma cells: a quantitative study using laser-captured microdissected tissues. Gynecologic Oncology. 98 (1), 104-110 (2005).
  9. Boulet, L., Karpati, G., Shoubridge, E. A. Distribution and threshold expression of the tRNA(Lys) mutation in skeletal muscle of patients with myoclonic epilepsy and ragged-red fibers (MERRF). American Journal of Human Genetics. 51 (6), 1187-1200 (1992).
  10. Lee, J., Hyeon, D. Y., Hwang, D. Single-cell multiomics: technologies and data analysis methods. Experimental and Molecular Medicine. 52 (9), 1428-1442 (2020).
  11. Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet Digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7 (1), 2409 (2017).
  12. Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).
  13. Herbst, A., et al. Digital PCR quantitation of muscle mitochondrial DNA: age, fiber type, and mutation-induced changes. Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 72 (10), 1327-1333 (2017).
  14. O'Hara, R., et al. Quantitative mitochondrial DNA copy number determination using droplet digital PCR with single-cell resolution. Genome Research. 29 (11), 1878-1888 (2019).
  15. Diaz, F., et al. Human mitochondrial DNA with large deletions repopulates organelles faster than full-length genomes under relaxed copy number control. Nucleic Acids Research. 30 (21), 4626-4633 (2002).
  16. Krishnan, K. J., Bender, A., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. A multiplex real-time PCR method to detect and quantify mitochondrial DNA deletions in individual cells. Analytical Biochemistry. 370 (1), 127-129 (2007).
  17. Lowes, H., Pyle, A., Duddy, M., Hudson, G. Cell-free mitochondrial DNA in progressive multiple sclerosis. Mitochondrion. 46, 307-312 (2019).
  18. Perier, C., et al. Accumulation of mitochondrial DNA deletions within dopaminergic neurons triggers neuroprotective mechanisms. Brain. 136, 2369-2378 (2013).
  19. Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). European Journal of Immunology. 49 (10), 1457 (2019).
  20. Espina, V., et al. Laser-capture microdissection. Nature Protocols. 1 (2), 586-603 (2006).
  21. Cree, L. M., et al. A reduction of mitochondrial DNA molecules during embryogenesis explains the rapid segregation of genotypes. Nature Genetics. 40 (2), 249-254 (2008).
  22. Belmonte, F. R., et al. Digital PCR methods improve detection sensitivity and measurement precision of low abundance mtDNA deletions. Scientific Reports. 6, 25186 (2016).
  23. Samuels, D. C., Schon, E. A., Chinnery, P. F. Two direct repeats cause most human mtDNA deletions. Trends in Genetics. 20 (9), 393-398 (2004).
  24. Nissanka, N., Minczuk, M., Moraes, C. T. Mechanisms of mitochondrial DNA deletion formation. Trends in Genetics. 35 (3), 235-244 (2019).
  25. Macaulay, I. C., et al. Separation and parallel sequencing of the genomes and transcriptomes of single cells using G&T-seq. Nature Protocols. 11 (11), 2081-2103 (2016).
  26. Ludwig, L. S., et al. Lineage tracing in humans enabled by mitochondrial mutations and single-cell genomics. Cell. 176 (6), 1325-1339 (2019).
  27. Rooney, J. P., et al. PCR based determination of mitochondrial DNA copy number in multiple species. Methods in Molecular Biology. 1241, 23-38 (2015).
  28. Kamitaki, N., Usher, C. L., McCarroll, S. A. Using droplet digital PCR to analyze allele-specific RNA expression. Methods in Molecular Biology. 1768, 401-422 (2018).
  29. Maeda, R., Kami, D., Maeda, H., Shikuma, A., Gojo, S. High throughput single cell analysis of mitochondrial heteroplasmy in mitochondrial diseases. Scientific Reports. 10 (1), 10821 (2020).
  30. Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. dPCR: A Technology Review. Sensors (Basel). 18 (4), (2018).
  31. Lin, X., Huang, X., Urmann, K., Xie, X., Hoffmann, M. R. Digital loop-mediated isothermal amplification on a commercial membrane. ACS Sensors. 4 (1), 242-249 (2019).
  32. Li, Z., et al. Fully integrated microfluidic devices for qualitative, quantitative and digital nucleic acids testing at point of care. Biosensors and Bioelectronics. 177, 112952 (2021).

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved