JoVE Logo
Faculty Resource Center
Authors
Librarians
High Schools
About

Sign In

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Acknowledgements

Materials

References

Biology

من أسفل إلى أعلى في طرق المختبر لفحص التنظيم فوق الهيكلي ، وإعادة تشكيل الغشاء ، وسلوك حساسية الانحناء للسبتين

Published: August 17th, 2022

DOI:

10.3791/63889

1Laboratoire Physico Chimie Curie, Institut Curie, PSL Research University, Sorbonne Université, 2Institut Fresnel, CNRS UMR7249, Aix Marseille Univ, Centrale Marseille, 3Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience Delft, Delft University of Technology, 4Department of Chemical Engineering, Imperial College London, 5Sorbonne Université, CNRS, Institut de Biologie Paris-Seine (IBPS), Service de microscopie électronique (IBPS-SME), 6Laboratoire Matière et Systèmes Complexes (MSC), Université Paris Cité, 7Institute of Biotechnology, Czech Academy of Sciences, BIOCEV
* These authors contributed equally

Septins هي بروتينات هيكلية خلوية. تتفاعل مع الأغشية الدهنية ويمكن أن تستشعر ولكنها تولد أيضا انحناء الغشاء على مقياس الميكرون. نحن نصف في هذا البروتوكول منهجيات من أسفل إلى أعلى في المختبر لتحليل تشوهات الغشاء ، وربط السيتين الحساس للانحناء ، والبنية الفائقة لخيوط السيفتين.

تحدث إعادة تشكيل الغشاء باستمرار في غشاء البلازما وداخل العضيات الخلوية. لتشريح دور البيئة بالكامل (الظروف الأيونية ، تركيبات البروتين والدهون ، انحناء الغشاء) والشركاء المختلفين المرتبطين بعمليات إعادة تشكيل غشاء محددة ، نتعهد في المختبر بنهج من أسفل إلى أعلى. في السنوات الأخيرة ، كان هناك اهتمام كبير بالكشف عن دور بروتينات السيبتين المرتبطة بالأمراض الرئيسية. Septins هي بروتينات هيكلية خلوية أساسية ومنتشرة في كل مكان تتفاعل مع غشاء البلازما. وهي متورطة في انقسام الخلايا ، وحركية الخلية ، والتشكل العصبي ، وتكوين الحيوانات المنوية ، من بين وظائف أخرى. لذلك ، من المهم فهم كيفية تفاعل السيبتين وتنظيمها في الأغشية للحث لاحقا على تشوهات الغشاء وكيف يمكن أن تكون حساسة لانحناءات غشائية محددة. تهدف هذه المقالة إلى فك رموز التفاعل بين البنية الفائقة للسبتين على المستوى الجزيئي وإعادة تشكيل الغشاء التي تحدث على نطاق ميكرون. تحقيقا لهذه الغاية ، تم التعبير عن الخميرة الناشئة ، ومجمعات سبتين الثدييات بشكل مؤتلف وتنقيتها. ثم تم استخدام مزيج من الفحوصات في المختبر لتحليل التجميع الذاتي للسبتين في الغشاء. تم استخدام الطبقات الثنائية الدهنية المدعومة (SLBs) ، وحويصلات unilamellar العملاقة (GUVs) ، وحويصلات unilamellar الكبيرة (LUVs) ، والركائز المتموجة لدراسة التفاعل بين التجميع الذاتي للسبتين ، وإعادة تشكيل الغشاء ، وانحناء الغشاء.

Septins هي بروتينات مكونة للخيوط الخلوية الهيكلية تتفاعل مع الأغشية الدهنية. Septins موجودة في كل مكان في حقيقيات النوى وضرورية للعديد من الوظائف الخلوية. وقد تم تحديدها على أنها المنظمين الرئيسيين لانقسام الخلايا في الخميرة الناشئة والثدييات 1,2. وهي تشارك في أحداث إعادة تشكيل الغشاء ، وتكوين الأهداب3 ، وتكوين الحيوانات المنوية4. داخل خلايا الثدييات ، يمكن أن تتفاعل السيبتين أيضا مع الأكتين والأنابيب الدقيقة5،6،7 في رابط من Rho GTPases (BORG) بطريقة تعتمد

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. تحديد إعادة تشكيل الغشاء باستخدام حويصلات أحادية الصفيحة العملاقة (GUVs)

ملاحظة: في هذا القسم ، يتم إنشاء GUVs لتقليد تشوهات الغشاء التي قد تسببها السيبتين في سياق خلوي. في الواقع ، في الخلايا ، غالبا ما توجد السيبتين في مواقع ذات انحناءات ميكرومترية. GUVs لها أحجام تترا?.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

تشوهات GUVs
يتم عرض صور التألق البؤري النموذجية للمركبات متعددة الاستخدامات التي أعيد تشكيلها بعد احتضانها بالسيبتين في الشكل 3 ، في الظروف التي تتبلمر فيها السيبتين. كانت GUVs العارية (الشكل 3A) كروية تماما. عند الحضانة بأكثر من 50 نانومتر من خيوط الخ?.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

كما ذكر أعلاه ، تم استخدام خليط الدهون الذي يعزز دمج PI (4,5) P2 داخل الطبقة الثنائية للدهون وبالتالي يسهل التفاعلات بين غشاء السبعين. في الواقع ، لقد أظهرنا في مكان آخر25 أن سبتين الخميرة الناشئة تتفاعل مع الحويصلات بطريقة PI (4,5) P2 الخاصة. تم تعديل تركيبة الدهون هذه تجري?.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ونشكر باتريشيا باسيريو ودانيال ليفي على مشورتهما ومناقشاتهما المفيدة. استفاد هذا العمل من دعم الوكالة الوطنية للبحوث لتمويل مشروع "SEPTIME" ، ANR-13-JSV8-0002-01 ، ANR SEPTIMORF ANR-17-CE13-0014 ، ومشروع "SEPTSCORT" ، ANR-20-CE11-0014-01. يتم تمويل B. Chauvin من قبل مدرسة الدكتوراه "ED564: Physique en Ile de France" ومؤسسة البحث العلمي. تم دعم K. Nakazawa من قبل جامعة السوربون (AAP Emergence). تم دعم G.H. Koenderink من قبل Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO / OCW) من خلال "BaSyC-Building a Synthetic Cell". منحة الجاذبية (024.003.019). نشكر مقياس Labex Cell(n) (ANR-11-LABX0038) وباريس للعلوم والآداب (ANR-10-IDEX-0001-02). نشكر تصوير الخلايا وا....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamineAvanti Polar Lipids850725
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serineAvanti Polar Lipids840035
Bath sonicatorElmaElmasonic S10H
Bodipy-TR-Ceramideinvitrogen, Thermo Fischer scientific11504726
Chemicals: NaCl, Tris-HCl, sucrose, KCl, MgCl2, B-casein, chloroform, sodium cacodylate, tannic acid, ethanolSigma Aldrich
Confocal microscopenikonspinning disk or confocal
Critical point dryerLeica microsystemsCPD300
Deionized water generatorMilliQF1CA38083BMilliQ integral 3
Egg L-α-phosphatidylcholineAvanti Polar Lipids840051
Field Emission Gun SEM (FESEM)Carl ZeissGemini SEM500
Glutaraldehyde 25 %, aqueous solutionThermo Fischer scientific50-262-19
High vacuum grease, Dow corningVWR
IMOD softwarehttps://bio3d.colorado.edu/imod/software suite for tilted series image alignment and 3D reconstruction
Lacey Formvar/carbon electron microscopy gridsEloise01883-F
LipidsAvanti Polar Lipids
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphateAvanti Polar Lipids840046
Metal evaporatorLeica microsystemsEM ACE600
NOA (Norland Optical Adhesives), NOA 71 and NOA 81Norland ProductsNOA71, NOA81
Osmium tetraoxyde 4%delta microscopies19170
OsmometerLöser15 M
Plasma cleanerAlcatelpascal 2005 SD
Plasma generatorElectron Microscopy Science
Plunge freezing equipmentleica microsystemsEMGP
Transmission electron microscopeThermofischerTecnai G2 200 kV, LaB6
Uranyl acetateElectron Microscopy Science22451this product is not available for purchase any longer
Wax plates, VitrexVWR

  1. Finger, F. P. Reining in cytokinesis with a septin corral. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 27 (1), 5-8 (2005).
  2. Barral, Y., Kinoshita, M. Structural insights shed light onto septin assemblies and function. Current Opinion in Cell Biology. 20 (1), 12-18 (2008).
  3. Hu, Q., et al. A septin diffusion barrier at the base of the primary cilium maintains ciliary membrane protein distribution. Science. 329 (5990), 436-439 (2010).
  4. Lin, Y. -. H., Kuo, Y. -. C., Chiang, H. -. S., Kuo, P. -. L. The role of the septin family in spermiogenesis. Spermatogenesis. 1 (4), 298-302 (2011).
  5. Addi, C., Bai, J., Echard, A. Actin, microtubule, septin and ESCRT filament remodeling during late steps of cytokinesis. Current Opinion in Cell Biology. 50, 27-34 (2018).
  6. Spiliotis, E. T., Kesisova, I. A. Spatial regulation of microtubule-dependent transport by septin GTPases. Trends in Cell Biology. 31 (12), 979-993 (2021).
  7. Spiliotis, E. T., Nakos, K. Cellular functions of actin- and microtubule-associated septins. Current Biology: CB. 31 (10), 651-666 (2021).
  8. Salameh, J., Cantaloube, I., Benoit, B., Poüs, C., Baillet, A. Cdc42 and its BORG2 and BORG3 effectors control the subcellular localization of septins between actin stress fibers and microtubules. Current Biology: CB. 31 (18), 4088-4103 (2021).
  9. Ewers, H., Tada, T., Petersen, J. D., Racz, B., Sheng, M., Choquet, D. A septin-dependent diffusion barrier at dendritic spine necks. PloS One. 9 (12), 113916 (2014).
  10. Myles, D. G., Primakoff, P., Koppel, D. E. A localized surface protein of guinea pig sperm exhibits free diffusion in its domain. The Journal of Cell Biology. 98 (5), 1905-1909 (1984).
  11. Luedeke, C., Frei, S. B., Sbalzarini, I., Schwarz, H., Spang, A., Barral, Y. Septin-dependent compartmentalization of the endoplasmic reticulum during yeast polarized growth. The Journal of Cell Biology. 169 (6), 897-908 (2005).
  12. Gilden, J. K., Peck, S., Chen, Y. -. C. M., Krummel, M. F. The septin cytoskeleton facilitates membrane retraction during motility and blebbing. The Journal of Cell Biology. 196 (1), 103-114 (2012).
  13. Dolat, L., Hu, Q., Spiliotis, E. T. Septin functions in organ system physiology and pathology. Biological Chemistry. 395 (2), 123-141 (2014).
  14. Angelis, D., Spiliotis, E. T. Septin mutations in human cancers. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 122 (2016).
  15. Takehashi, M., et al. Septin 3 gene polymorphism in Alzheimer's disease. Gene Expression. 11 (5-6), 263-270 (2004).
  16. Shuman, B., Momany, M. Septins from protists to people. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 824850 (2022).
  17. Bertin, A., et al. Saccharomyces cerevisiae septins: supramolecular organization of heterooligomers and the mechanism of filament assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (24), 8274-8279 (2008).
  18. Iv, F., et al. Insights into animal septins using recombinant human septin octamers with distinct SEPT9 isoforms. Journal of cell science. 134 (15), (2021).
  19. Beber, A., et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature communications. 10 (1), 420 (2019).
  20. Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. The Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).
  21. Patzig, J., et al. Septin/anillin filaments scaffold central nervous system myelin to accelerate nerve conduction. eLife. 5, 17119 (2016).
  22. Szuba, A., et al. Membrane binding controls ordered self-assembly of animal septins. eLife. 10, 63349 (2021).
  23. Tanaka-Takiguchi, Y., Kinoshita, M., Takiguchi, K. Septin-mediated uniform bracing of phospholipid membranes. Current Biology: CB. 19 (2), 140-145 (2009).
  24. Bertin, A., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate promotes budding yeast septin filament assembly and organization. Journal of Molecular Biology. 404 (4), 711-731 (2010).
  25. Beber, A., et al. Septin-based readout of PI(4,5)P2 incorporation into membranes of giant unilamellar vesicles. Cytoskeleton. 76 (4,5), 92-103 (2019).
  26. Mastronarde, D. N., Held, S. R. Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD. Journal of Structural Biology. 197 (2), 102-113 (2017).
  27. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
  28. Nania, M., Foglia, F., Matar, O. K., Cabral, J. T. Sub-100 nm wrinkling of polydimethylsiloxane by double frontal oxidation. Nanoscale. 9 (5), 2030-2037 (2017).
  29. Nania, M., Matar, O. K., Cabral, J. T. Frontal vitrification of PDMS using air plasma and consequences for surface wrinkling. Soft Matter. 11 (15), 3067-3075 (2015).
  30. Svitkina, T. M., Borisy, G. G. Correlative light and electron microscopy of the cytoskeleton of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 570-592 (1998).
  31. Franck, A., et al. Clathrin plaques and associated actin anchor intermediate filaments in skeletal muscle. Molecular Biology of the Cell. 30 (5), 579-590 (2019).
  32. Elkhatib, N., et al. Tubular clathrin/AP-2 lattices pinch collagen fibers to support 3D cell migration. Science. 356 (6343), (2017).
  33. Stokroos, I., Kalicharan, D., Van Der Want, J. J., Jongebloed, W. L. A comparative study of thin coatings of Au/Pd, Pt and Cr produced by magnetron sputtering for FE-SEM. Journal of Microscopy. 189, 79-89 (1998).

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved