Bottom-up in vitro-metoder til analyse af den ultrastrukturelle organisation, membranomformning og krumningsfølsomhedsadfærd hos septiner

Septiner er cytoskeletale proteiner. De interagerer med lipidmembraner og kan fornemme, men også generere membrankrumning på mikronskala. Vi beskriver i denne protokol bottom-up in vitro-metoder til analyse af membrandeformationer, krumningsfølsom septinbinding og septinfilament ultrastruktur.

Membranombygning forekommer konstant ved plasmamembranen og inden for cellulære organeller. For fuldt ud at dissekere miljøets rolle (ioniske tilstande, protein- og lipidsammensætninger, membrankrumning) og de forskellige partnere, der er forbundet med specifikke membranomformningsprocesser, foretager vi in vitro bottom-up-tilgange. I de senere år har der været stor interesse for at afsløre septinproteinernes rolle forbundet med større sygdomme. Septiner er essentielle og allestedsnærværende cytoskeletale proteiner, der interagerer med plasmamembranen. De er impliceret i celledeling, cellemotilitet, neuromorfogenese og spermiogenese, blandt andre funktioner. Det er derfor vigtigt at forstå, hvordan septiner interagerer og organiserer sig ved membraner for efterfølgende at inducere membrandeformationer, og hvordan de kan være følsomme over for specifikke membrankrumninger. Denne artikel har til formål at dechiffrere samspillet mellem ultrastrukturen af septiner på molekylært niveau og membranombygningen, der forekommer på mikronskala. Til dette formål blev spirende gær og pattedyrs septinkomplekser rekombinant udtrykt og renset. En kombination af in vitro-assays blev derefter brugt til at analysere selvmonteringen af septiner ved membranen. Understøttede lipiddobbeltlag (SLB'er), gigantiske unilamellare vesikler (GUV'er), store unilamellare vesikler (LUV'er) og bølgede substrater blev brugt til at studere samspillet mellem septin selvsamling, membranomformning og membrankrumning.

Septiner er cytoskeletale filamentdannende proteiner, der interagerer med lipidmembraner. Septiner er allestedsnærværende i eukaryoter og afgørende for mange cellulære funktioner. De er blevet identificeret som de vigtigste regulatorer for celledeling i spirende gær og pattedyr ^1,2. De er involveret i membranomformningshændelser, ciliogenese³ og spermiogenese⁴. Inden for pattedyrceller kan septiner også interagere med actin og mikrotubuli ^5,6,7 i et bindemiddel af Rho GT....

1. Bestemmelse af membranomformning ved hjælp af gigantiske unilamellare vesikler (GUV'er)

BEMÆRK: I dette afsnit genereres GUV'er for at efterligne de membrandeformationer, der muligvis induceres af septiner i en cellulær sammenhæng. Faktisk findes septiner i celler ofte på steder med mikrometerkrumninger. GUV'er har størrelser fra et par til snesevis af mikrometer og kan deformeres. De er således egnede til at analysere eventuelle septininducerede deformationer i mikrom.......

GUVs deformationer
Typiske konfokale fluorescensbilleder af GUV'er omformet efter inkubation med septiner vises i figur 3 under forhold, hvor septiner polymeriserer. Bare GUV'er (figur 3A) var perfekt sfæriske. Ved inkubation med mere end 50 nM spirende gærseptinfilamenter syntes vesiklerne deformerede. Op til en koncentration på 100 nM spirende gærseptinoktomerer syntes vesiklerne facetterede, og deformationerne forblev statiske og sving.......

Som nævnt ovenfor er der anvendt en lipidblanding, der forbedrer PI (4,5) P 2-inkorporering i lipiddobbeltlaget og letter dermed septin-membraninteraktioner. Faktisk har vi vist andetsteds²⁵, at spirende gærseptiner interagerer med vesikler på en PI (4,5) P_2-specifik måde. Denne lipidsammensætning blev justeret empirisk fra screening af flere sammensætninger og anvendes nu i vid udstrækning af forfatterne. PI(4,5)P₂ lipider skal håndteres omhyggeligt. Stamo.......

Vi takker Patricia Bassereau og Daniel Lévy for deres nyttige råd og diskussioner. Dette arbejde modtog støtte fra ANR (Agence Nationale de la Recherche) til finansiering af projektet "SEPTIME", ANR-13-JSV8-0002-01, ANR SEPTIMORF ANR-17-CE13-0014 og projektet "SEPTSCORT", ANR-20-CE11-0014-01. B. Chauvin er finansieret af Ecole Doctorale "ED564: Physique en Ile de France" og Fondation pour lea Recherche Médicale. K. Nakazawa blev støttet af Sorbonne Université (AAP Emergence). G.H. Koenderink blev støttet af Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO/OCW) gennem »BaSyC-Building a Synthetic Cell«. Gravitationstilskud (024.003.019). Vi takker Labex Cell....