JoVE Logo
Faculty Resource Center
Authors
Librarians
High Schools
About

Sign In

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Acknowledgements

Materials

References

Biology

Bottom-up in vitro methoden om de ultrastructurele organisatie, membraanhervorming en krommingsgevoeligheidsgedrag van septines te testen

Published: August 17th, 2022

DOI:

10.3791/63889

1Laboratoire Physico Chimie Curie, Institut Curie, PSL Research University, Sorbonne Université, 2Institut Fresnel, CNRS UMR7249, Aix Marseille Univ, Centrale Marseille, 3Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience Delft, Delft University of Technology, 4Department of Chemical Engineering, Imperial College London, 5Sorbonne Université, CNRS, Institut de Biologie Paris-Seine (IBPS), Service de microscopie électronique (IBPS-SME), 6Laboratoire Matière et Systèmes Complexes (MSC), Université Paris Cité, 7Institute of Biotechnology, Czech Academy of Sciences, BIOCEV
* These authors contributed equally

Septines zijn cytoskeletale eiwitten. Ze interageren met lipidembranen en kunnen membraankromming op micronschaal waarnemen maar ook genereren. We beschrijven in dit protocol bottom-up in vitro methodologieën voor het analyseren van membraanvervormingen, krommingsgevoelige septinebinding en septinefilament ultrastructuur.

Membraanremodellering vindt constant plaats op het plasmamembraan en in cellulaire organellen. Om de rol van de omgeving (ionische condities, eiwit- en lipidensamenstellingen, membraankromming) en de verschillende partners geassocieerd met specifieke membraanhervormingsprocessen volledig te ontleden, ondernemen we in vitro bottom-up benaderingen. In de afgelopen jaren is er grote belangstelling geweest voor het onthullen van de rol van septine-eiwitten geassocieerd met belangrijke ziekten. Septines zijn essentiële en alomtegenwoordige cytoskeletale eiwitten die interageren met het plasmamembraan. Ze zijn betrokken bij celdeling, celmotiliteit, neuromorfogenese en spermiogenese, naast andere functies. Het is daarom belangrijk om te begrijpen hoe septines interageren en organiseren op membranen om vervolgens membraanvervormingen te induceren en hoe ze gevoelig kunnen zijn voor specifieke membraankrommingen. Dit artikel heeft tot doel het samenspel te ontcijferen tussen de ultrastructuur van septines op moleculair niveau en de membraanremodellering op micronschaal. Daartoe werden ontluikende gist- en zoogdierseptinecomplexen recombinant tot expressie gebracht en gezuiverd. Een combinatie van in vitro assays werd vervolgens gebruikt om de zelfassemblage van septines aan het membraan te analyseren. Ondersteunde lipide bilayers (SLBs), gigantische unilamellaire blaasjes (GUVs), grote unilamellaire blaasjes (LUVs) en golvende substraten werden gebruikt om het samenspel tussen septine zelfassemblage, membraanverandering en membraankromming te bestuderen.

Septines zijn cytoskeletale filamentvormende eiwitten die interageren met lipidembranen. Septines zijn alomtegenwoordig in eukaryoten en essentieel voor tal van cellulaire functies. Ze zijn geïdentificeerd als de belangrijkste regulatoren van celdeling in ontluikende gist en zoogdieren 1,2. Ze zijn betrokken bij membraanhervormingsgebeurtenissen, ciliogenese3 en spermiogenese4. In zoogdiercellen kunnen septines ook interageren met actine en microtubuli 5,6,7 in een bindm....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Bepaling van membraanhervormen met behulp van gigantische unilamellaire blaasjes (GUVs)

OPMERKING: In deze sectie worden GUVs gegenereerd om de membraanvervormingen na te bootsen die mogelijk worden veroorzaakt door septines in een cellulaire context. Inderdaad, in cellen worden septines vaak gevonden op plaatsen met micrometerkrommingen. GUVs hebben afmetingen variërend van enkele tot tientallen micrometers en kunnen worden vervormd. Ze zijn dus geschikt om eventuele septin.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

GUVs vervormingen
Typische confocale fluorescentiebeelden van GUVs die opnieuw zijn gevormd nadat ze zijn geïncubeerd met septines, worden weergegeven in figuur 3, in omstandigheden waarin septines polymeriseren. Kale GUVs (figuur 3A) waren perfect bolvormig. Bij incubatie met meer dan 50 nM ontluikende gist septineslamenten leken de blaasjes vervormd. Tot een concentratie van 100 nM ontluikende gistseptine-octameren leken de blaasjes geface.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Zoals hierboven vermeld, is een lipidenmengsel gebruikt dat de PI(4,5)P2-opname in de lipide bilaag verbetert en zo septine-membraaninteracties vergemakkelijkt. Inderdaad, we hebben elders25 aangetoond dat ontluikende gist septines interageren met blaasjes op een PI(4,5)P2-specifieke manier. Deze lipidesamenstelling werd empirisch aangepast door het screenen van meerdere samenstellingen en wordt nu veel gebruikt door de auteurs. PI(4,5)P2 lipiden moeten zorgvuldig .......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Wij danken Patricia Bassereau en Daniel Lévy voor hun nuttige adviezen en discussies. Dit werk heeft de steun gekregen van het ANR (Agence Nationale de la Recherche) voor de financiering van het project "SEPTIME", ANR-13-JSV8-0002-01, ANR SEPTIMORF ANR-17-CE13-0014 en het project "SEPTSCORT", ANR-20-CE11-0014-01. B. Chauvin wordt gefinancierd door de Ecole Doctorale "ED564: Physique en Ile de France" en Fondation pour lea Recherche Médicale. K. Nakazawa werd ondersteund door Sorbonne Université (AAP Emergence). G.H. Koenderink werd ondersteund door de Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO/OCW) via de 'BaSyC-Building a Synthetic Cell'. Zwaartekra....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamineAvanti Polar Lipids850725
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serineAvanti Polar Lipids840035
Bath sonicatorElmaElmasonic S10H
Bodipy-TR-Ceramideinvitrogen, Thermo Fischer scientific11504726
Chemicals: NaCl, Tris-HCl, sucrose, KCl, MgCl2, B-casein, chloroform, sodium cacodylate, tannic acid, ethanolSigma Aldrich
Confocal microscopenikonspinning disk or confocal
Critical point dryerLeica microsystemsCPD300
Deionized water generatorMilliQF1CA38083BMilliQ integral 3
Egg L-α-phosphatidylcholineAvanti Polar Lipids840051
Field Emission Gun SEM (FESEM)Carl ZeissGemini SEM500
Glutaraldehyde 25 %, aqueous solutionThermo Fischer scientific50-262-19
High vacuum grease, Dow corningVWR
IMOD softwarehttps://bio3d.colorado.edu/imod/software suite for tilted series image alignment and 3D reconstruction
Lacey Formvar/carbon electron microscopy gridsEloise01883-F
LipidsAvanti Polar Lipids
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphateAvanti Polar Lipids840046
Metal evaporatorLeica microsystemsEM ACE600
NOA (Norland Optical Adhesives), NOA 71 and NOA 81Norland ProductsNOA71, NOA81
Osmium tetraoxyde 4%delta microscopies19170
OsmometerLöser15 M
Plasma cleanerAlcatelpascal 2005 SD
Plasma generatorElectron Microscopy Science
Plunge freezing equipmentleica microsystemsEMGP
Transmission electron microscopeThermofischerTecnai G2 200 kV, LaB6
Uranyl acetateElectron Microscopy Science22451this product is not available for purchase any longer
Wax plates, VitrexVWR

  1. Finger, F. P. Reining in cytokinesis with a septin corral. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 27 (1), 5-8 (2005).
  2. Barral, Y., Kinoshita, M. Structural insights shed light onto septin assemblies and function. Current Opinion in Cell Biology. 20 (1), 12-18 (2008).
  3. Hu, Q., et al. A septin diffusion barrier at the base of the primary cilium maintains ciliary membrane protein distribution. Science. 329 (5990), 436-439 (2010).
  4. Lin, Y. -. H., Kuo, Y. -. C., Chiang, H. -. S., Kuo, P. -. L. The role of the septin family in spermiogenesis. Spermatogenesis. 1 (4), 298-302 (2011).
  5. Addi, C., Bai, J., Echard, A. Actin, microtubule, septin and ESCRT filament remodeling during late steps of cytokinesis. Current Opinion in Cell Biology. 50, 27-34 (2018).
  6. Spiliotis, E. T., Kesisova, I. A. Spatial regulation of microtubule-dependent transport by septin GTPases. Trends in Cell Biology. 31 (12), 979-993 (2021).
  7. Spiliotis, E. T., Nakos, K. Cellular functions of actin- and microtubule-associated septins. Current Biology: CB. 31 (10), 651-666 (2021).
  8. Salameh, J., Cantaloube, I., Benoit, B., Poüs, C., Baillet, A. Cdc42 and its BORG2 and BORG3 effectors control the subcellular localization of septins between actin stress fibers and microtubules. Current Biology: CB. 31 (18), 4088-4103 (2021).
  9. Ewers, H., Tada, T., Petersen, J. D., Racz, B., Sheng, M., Choquet, D. A septin-dependent diffusion barrier at dendritic spine necks. PloS One. 9 (12), 113916 (2014).
  10. Myles, D. G., Primakoff, P., Koppel, D. E. A localized surface protein of guinea pig sperm exhibits free diffusion in its domain. The Journal of Cell Biology. 98 (5), 1905-1909 (1984).
  11. Luedeke, C., Frei, S. B., Sbalzarini, I., Schwarz, H., Spang, A., Barral, Y. Septin-dependent compartmentalization of the endoplasmic reticulum during yeast polarized growth. The Journal of Cell Biology. 169 (6), 897-908 (2005).
  12. Gilden, J. K., Peck, S., Chen, Y. -. C. M., Krummel, M. F. The septin cytoskeleton facilitates membrane retraction during motility and blebbing. The Journal of Cell Biology. 196 (1), 103-114 (2012).
  13. Dolat, L., Hu, Q., Spiliotis, E. T. Septin functions in organ system physiology and pathology. Biological Chemistry. 395 (2), 123-141 (2014).
  14. Angelis, D., Spiliotis, E. T. Septin mutations in human cancers. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 122 (2016).
  15. Takehashi, M., et al. Septin 3 gene polymorphism in Alzheimer's disease. Gene Expression. 11 (5-6), 263-270 (2004).
  16. Shuman, B., Momany, M. Septins from protists to people. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 824850 (2022).
  17. Bertin, A., et al. Saccharomyces cerevisiae septins: supramolecular organization of heterooligomers and the mechanism of filament assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (24), 8274-8279 (2008).
  18. Iv, F., et al. Insights into animal septins using recombinant human septin octamers with distinct SEPT9 isoforms. Journal of cell science. 134 (15), (2021).
  19. Beber, A., et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature communications. 10 (1), 420 (2019).
  20. Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. The Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).
  21. Patzig, J., et al. Septin/anillin filaments scaffold central nervous system myelin to accelerate nerve conduction. eLife. 5, 17119 (2016).
  22. Szuba, A., et al. Membrane binding controls ordered self-assembly of animal septins. eLife. 10, 63349 (2021).
  23. Tanaka-Takiguchi, Y., Kinoshita, M., Takiguchi, K. Septin-mediated uniform bracing of phospholipid membranes. Current Biology: CB. 19 (2), 140-145 (2009).
  24. Bertin, A., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate promotes budding yeast septin filament assembly and organization. Journal of Molecular Biology. 404 (4), 711-731 (2010).
  25. Beber, A., et al. Septin-based readout of PI(4,5)P2 incorporation into membranes of giant unilamellar vesicles. Cytoskeleton. 76 (4,5), 92-103 (2019).
  26. Mastronarde, D. N., Held, S. R. Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD. Journal of Structural Biology. 197 (2), 102-113 (2017).
  27. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
  28. Nania, M., Foglia, F., Matar, O. K., Cabral, J. T. Sub-100 nm wrinkling of polydimethylsiloxane by double frontal oxidation. Nanoscale. 9 (5), 2030-2037 (2017).
  29. Nania, M., Matar, O. K., Cabral, J. T. Frontal vitrification of PDMS using air plasma and consequences for surface wrinkling. Soft Matter. 11 (15), 3067-3075 (2015).
  30. Svitkina, T. M., Borisy, G. G. Correlative light and electron microscopy of the cytoskeleton of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 570-592 (1998).
  31. Franck, A., et al. Clathrin plaques and associated actin anchor intermediate filaments in skeletal muscle. Molecular Biology of the Cell. 30 (5), 579-590 (2019).
  32. Elkhatib, N., et al. Tubular clathrin/AP-2 lattices pinch collagen fibers to support 3D cell migration. Science. 356 (6343), (2017).
  33. Stokroos, I., Kalicharan, D., Van Der Want, J. J., Jongebloed, W. L. A comparative study of thin coatings of Au/Pd, Pt and Cr produced by magnetron sputtering for FE-SEM. Journal of Microscopy. 189, 79-89 (1998).

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved