Méthodes in vitro ascendantes pour tester l’organisation ultrastructurale, le remodelage de la membrane et le comportement de sensibilité à la courbure des septines

Les septines sont des protéines cytosquelettiques. Ils interagissent avec les membranes lipidiques et peuvent détecter mais aussi générer une courbure de membrane à l’échelle du micron. Nous décrivons dans ce protocole des méthodologies in vitro ascendantes pour l’analyse des déformations membranaires, la liaison de la septine sensible à la courbure et l’ultrastructure du filament de septine.

Le remodelage membranaire se produit constamment au niveau de la membrane plasmique et dans les organites cellulaires. Pour décortiquer complètement le rôle de l’environnement (conditions ioniques, compositions protéiques et lipidiques, courbure membranaire) et des différents partenaires associés à des processus spécifiques de remodelage membranaire, nous entreprenons des approches ascendantes in vitro . Ces dernières années, on a manifesté un vif intérêt pour révéler le rôle des protéines septines associées aux principales maladies. Les septines sont des protéines cytosquelettiques essentielles et omniprésentes qui interagissent avec la membrane plasmique. Ils sont impliqués dans la division cellulaire, la motilité cellulaire, la neuro-morphogenèse et la spermiogenèse, entre autres fonctions. Il est donc important de comprendre comment les septines interagissent et s’organisent au niveau des membranes pour induire ensuite des déformations membranaires et comment elles peuvent être sensibles à des courbures membranaires spécifiques. Cet article vise à déchiffrer l’interaction entre l’ultra-structure des septines au niveau moléculaire et le remodelage membranaire se produisant à l’échelle du micron. À cette fin, des complexes de levure bourgeonnante et de septine de mammifères ont été exprimés et purifiés de manière recombinante. Une combinaison de tests in vitro a ensuite été utilisée pour analyser l’auto-assemblage des septines au niveau de la membrane. Des bicouches lipidiques soutenues (SLB), des vésicules unilamellaires géantes (GUV), de grandes vésicules unilamellaires (LUV) et des substrats ondulés ont été utilisés pour étudier l’interaction entre l’auto-assemblage de la septine, le remodelage de la membrane et la courbure de la membrane.

Les septines sont des protéines formant des filaments cytosquelettiques qui interagissent avec les membranes lipidiques. Les septines sont omniprésentes chez les eucaryotes et essentielles à de nombreuses fonctions cellulaires. Ils ont été identifiés comme les principaux régulateurs de la division cellulaire chez les levures bourgeonnantes et les mammifères ^1,2. Ils sont impliqués dans les événements de remodelage membranaire, la ciliogenèse³ et la spermiogenèse⁴. Dans les cellules de mammifères, les septines peuvent également interagir avec l’actine et les micro....

1. Détermination du remodelage de la membrane à l’aide de vésicules unilamellaires géantes (GUV)

REMARQUE: Dans cette section, les GUV sont générés pour imiter les déformations membranaires éventuellement induites par les septines dans un contexte cellulaire. En effet, dans les cellules, les septines se retrouvent fréquemment sur des sites à courbures micrométriques. Les GUV ont des tailles allant de quelques à quelques dizaines de micromètres et peuvent être d?.......

Déformations des GUV
Des images confocales typiques de fluorescence de GUV remodelés après avoir été incubés avec des septines sont présentées à la figure 3, dans des conditions où les septines polymérisent. Les GUV nus (Figure 3A) étaient parfaitement sphériques. Lors de l’incubation avec plus de 50 nM de filaments de septine de levure bourgeonnante, les vésicules sont apparues déformées. Jusqu’à une concentration de 100.......

Comme indiqué ci-dessus, un mélange lipidique a été utilisé qui améliore l’incorporation de PI(4,5)P₂ dans la bicouche lipidique et facilite ainsi les interactions septine-membrane. En effet, nous avons montré ailleurs²⁵ que les septines de levure bourgeonnantes interagissent avec les vésicules de manière spécifique à PI(4,5)_P2. Cette composition lipidique a été ajustée empiriquement à partir du criblage de plusieurs compositions et est maintenant largement u.......

Nous remercions Patricia Bassereau et Daniel Lévy pour leurs précieux conseils et discussions. Ces travaux ont bénéficié du soutien de l’ANR (Agence Nationale de la Recherche) pour le financement du projet « SEPTIME », ANR-13-JSV8-0002-01, de l’ANR septimorf ANR-17-CE13-0014, et du projet « SEPTSCORT », ANR-20-CE11-0014-01. B. Chauvin est financé par l’Ecole Doctorale « ED564: Physique en Ile de France » et la Fondation pour lea Recherche Médicale. K. Nakazawa a été soutenu par Sorbonne Université (AAP Emergence). G.H. Koenderink a été soutenu par la Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO/OCW) par le biais du « BaSyC-Building a Synthetic Cell ». ....