Bottom-up In vitro Methoden zur Untersuchung der ultrastrukturellen Organisation, der Membranumformung und des Krümmungsempfindlichkeitsverhaltens von Septinen

Septine sind Zytoskelettproteine. Sie interagieren mit Lipidmembranen und können Membrankrümmungen im Mikrometerbereich wahrnehmen, aber auch erzeugen. Wir beschreiben in diesem Protokoll Bottom-up-In-vitro-Methoden zur Analyse von Membranverformungen, krümmungsempfindlicher Septinbindung und Septinfilament-Ultrastruktur.

Der Membranumbau findet ständig an der Plasmamembran und in zellulären Organellen statt. Um die Rolle der Umwelt (ionische Bedingungen, Protein- und Lipidzusammensetzungen, Membrankrümmung) und die verschiedenen Partner, die mit spezifischen Membranumformungsprozessen verbunden sind, vollständig zu analysieren, verfolgen wir In-vitro-Bottom-up-Ansätze. In den letzten Jahren gab es ein großes Interesse daran, die Rolle von Septinproteinen im Zusammenhang mit schweren Krankheiten aufzudecken. Septine sind essentielle und allgegenwärtige Zytoskelettproteine, die mit der Plasmamembran interagieren. Sie sind unter anderem an der Zellteilung, Zellmotilität, Neuromorphogenese und Spermiogenese beteiligt. Es ist daher wichtig zu verstehen, wie Septine an Membranen interagieren und sich organisieren, um anschließend Membranverformungen zu induzieren und wie sie empfindlich auf bestimmte Membrankrümmungen reagieren können. Dieser Artikel zielt darauf ab, das Zusammenspiel zwischen der Ultrastruktur von Septinen auf molekularer Ebene und dem Membranumbau im Mikrometerbereich zu entschlüsseln. Zu diesem Zweck wurden knospende Hefe und Säugetierseptinkomplexe rekombinant exprimiert und gereinigt. Eine Kombination von In-vitro-Assays wurde dann verwendet, um die Selbstorganisation von Septinen an der Membran zu analysieren. Unterstützte Lipiddoppelschichten (SLBs), riesige unilamellare Vesikel (GUVs), große unilamellare Vesikel (LUVs) und wellige Substrate wurden verwendet, um das Zusammenspiel zwischen Septin-Selbstorganisation, Membranumformung und Membrankrümmung zu untersuchen.

Septine sind filamentbildende Proteine des Zytoskeletts, die mit Lipidmembranen interagieren. Septine sind in Eukaryoten allgegenwärtig und essentiell für zahlreiche zelluläre Funktionen. Sie wurden als die Hauptregulatoren der Zellteilung in knospender Hefe und Säugetieren identifiziert ^1,2. Sie sind an Membranumformungsereignissen, Ziliogenese³ und Spermiogenese⁴ beteiligt. Innerhalb von Säugetierzellen können Septine auch mit Aktin und Mikrotubuli ^5,6,7 i....

1. Bestimmung der Membranumformung mittels riesiger unilamellärer Vesikel (GUVs)

HINWEIS: In diesem Abschnitt werden GUVs erzeugt, um die Membranverformungen nachzuahmen, die möglicherweise durch Septine in einem zellulären Kontext induziert werden. Tatsächlich werden Septine in Zellen häufig an Stellen mit Mikrometerkrümmungen gefunden. GUVs haben Größen von wenigen bis zu zehn Mikrometern und können verformt werden. Sie sind daher geeignet, septinininduzierte Verformu.......

GUVs-Verformungen
Typische konfokale Fluoreszenzbilder von GUVs, die nach der Inkubation mit Septinen umgeformt wurden, sind in Abbildung 3 unter Bedingungen dargestellt, unter denen Septine polymerisieren. Blanke GUVs (Abbildung 3A) waren perfekt kugelförmig. Bei der Inkubation mit mehr als 50 nM knospenden Hefeseptinfilamenten erschienen die Vesikel deformiert. Bis zu einer Konzentration von 100 nM knospenden Hefeseptin-Oktameren erschiene.......

Wie oben erwähnt, wurde eine Lipidmischung verwendet, die den Einbau von PI(4,5)_P2 in die Lipiddoppelschicht verstärkt und somit Septin-Membran-Wechselwirkungen erleichtert. Tatsächlich haben wir an anderer Stelle²⁵ gezeigt, dass knospende Hefeseptine mit Vesikeln in einer PI(4,5)P_{2-spezifischen} Weise interagieren. Diese Lipidzusammensetzung wurde empirisch aus dem Screening mehrerer Zusammensetzungen angepasst und wird heute von den Autoren häufig verwendet. PI(4,5)_.......

Wir danken Patricia Bassereau und Daniel Lévy für ihre nützlichen Ratschläge und Gespräche. Diese Arbeit profitierte von der Unterstützung der ANR (Agence Nationale de la Recherche) für die Finanzierung der Projekte "SEPTIME", ANR-13-JSV8-0002-01, ANR SEPTIMORF ANR-17-CE13-0014, und des Projekts "SEPTSCORT", ANR-20-CE11-0014-01. B. Chauvin wird von der Ecole Doctorale "ED564: Physique en Ile de France" und der Fondation pour lea Recherche Médicale finanziert. K. Nakazawa wurde von der Sorbonne Université (AAP Emergence) unterstützt. G.H. Koenderink wurde von der Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO/OCW) durch die "BaSyC-Building a Synthetic Cel....