Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Biology
ספטינים הם חלבונים ציטוסקטליים. הם מתקשרים עם ממברנות שומנים ויכולים לחוש אך גם ליצור עקמומיות ממברנה בקנה מידה של מיקרון. אנו מתארים בפרוטוקול זה מתודולוגיות in vitro מלמטה למעלה לניתוח עיוותים של ממברנות, קשירת ספטין רגישה לעקמומיות ואולטרה-מבנה של נימה ספטין.
שיפוץ ממברנה מתרחש כל הזמן בקרום הפלזמה ובתוך אברוני התאים. כדי לנתח באופן מלא את תפקיד הסביבה (תנאים יוניים, הרכבי חלבונים ושומנים, עקמומיות הממברנה) ואת השותפים השונים הקשורים לתהליכי עיצוב מחדש של ממברנה ספציפיים, אנו נוקטים בגישות מלמטה למעלה במבחנה . בשנים האחרונות יש עניין רב בחשיפת תפקידם של חלבוני ספטין הקשורים למחלות גדולות. ספטינים הם חלבונים ציטוסקטליים חיוניים הנמצאים בכל מקום ומקיימים אינטראקציה עם קרום הפלזמה. הם מעורבים בחלוקת תאים, תנועתיות תאים, נוירו-מורפוגנזה, וזרעונים, בין תפקידים אחרים. לכן, חשוב להבין כיצד ספטינים מתקשרים ומתארגנים בממברנות כדי לגרום לאחר מכן לעיוותים של הממברנות וכיצד הם יכולים להיות רגישים לעקמומיות ממברנה ספציפית. מאמר זה נועד לפענח את יחסי הגומלין בין המבנה האולטרה-מבנה של ספטינים ברמה המולקולרית לבין שיפוץ הממברנה המתרחש בקנה מידה מיקרוני. לשם כך, שמרים ניצנים, ומתחמי ספטין של יונקים באו לידי ביטוי וטוהרו באופן רקומביננטי. לאחר מכן נעשה שימוש בשילוב של בדיקות חוץ גופיות כדי לנתח את ההרכבה העצמית של מחיצות בממברנה. דו-שכבתי שומנים נתמכים (SLBs), שלפוחיות חד-לשוניות ענקיות (GUVs), שלפוחיות חד-לשוניות גדולות (LUVs) ומצעים גליים שימשו כדי לחקור את יחסי הגומלין בין הרכבה עצמית של ספטין, עיצוב מחדש של הממברנה ועקמומיות הממברנה.
ספטינים הם חלבונים יוצרי חוטים ציטוסקטליים המקיימים אינטראקציה עם ממברנות שומנים. ספטינים נמצאים בכל מקום באאוקריוטים וחיוניים לתפקודים תאיים רבים. הם זוהו כמווסתים העיקריים של חלוקת תאים בשמרים ניצנים ויונקים 1,2. הם מעורבים באירועי עיצוב מחדש של הממברנות, ciliogenesis3, ו spermiogenesis4. בתוך תאי יונקים, ספטינים יכולים גם לקיים אינטראקציה עם אקטין ומיקרוטובולים 5,6,7 בקלסר של Rho GTPases (BORG) תלוי-אופן8. ברקמות שונות (נוירונים
1. קביעת עיצוב מחדש של הממברנה באמצעות שלפוחיות חד-עיניות ענקיות (GUVs)
הערה: בחלק זה, GUVs נוצרים כדי לחקות את עיוותי הממברנה שעשויים להיות מושרים על ידי ספטינים בהקשר תאי. ואכן, בתאים, ספטינים נמצאים לעתים קרובות באתרים עם עקמומיות מיקרומטר. לרכבי GUV יש גדלים הנעים בין כמ.......
עיוותים של רכבי שטח
תמונות פלואורסצנטיות קונפוקליות טיפוסיות של רכבי שטח שעוצבו מחדש לאחר דגירה באמצעות ספטינים מוצגות באיור 3, בתנאים שבהם ספטינים מתפלמרים. רכבי שטח חשופים (איור 3A) היו כדוריים לחלוטין. עם הדגירה עם יותר מ 50 nM ניצני שמרים חוטים se.......
כאמור, נעשה שימוש בתערובת שומנים המשפרת את שילוב PI(4,5)P2 בתוך דו-שכבת השומנים ובכך מקלה על אינטראקציות בין ממברנת ספטין. ואכן, הראינו במקומות אחרים25 כי מחיצות שמרים ניצנים אינטראקציה עם שלפוחית באופן ספציפי PI(4,5)P2. הרכב שומנים זה הותאם אמפירית מסינון יצירות מרובות וכ.......
אנו מודים לפטרישיה בסראו ודניאל לוי על העצות והדיונים המועילים שלהם. עבודה זו נהנתה מתמיכת ANR (הסוכנות הלאומית דה לה רשרש) למימון הפרויקט "SEPTIME", ANR-13-JSV8-0002-01, ANR SEPTIMORF ANR-17-CE13-0014, והפרויקט "SEPTSCORT", ANR-20-CE11-0014-01. B. Chauvin ממומן על ידי אקול דוקטורלה "ED564: Physique en Ile de France" ו- Fondation pour lea Recherche Médicale. K. Nakazawa נתמך על ידי אוניברסיטת סורבון (AAP Emergence). G.H. Koenderink נתמך על ידי ארגון Nederlandse voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO/OCW) באמצעות 'BaSyC-בניית תא סינתטי'. מענק כבידה (024.003.019). אנו מודים לסולם התאים של Labex (n) (ANR-11-LABX0038) ולפריז Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02). אנו מו....
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850725 | |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine | Avanti Polar Lipids | 840035 | |
Bath sonicator | Elma | Elmasonic S10H | |
Bodipy-TR-Ceramide | invitrogen, Thermo Fischer scientific | 11504726 | |
Chemicals: NaCl, Tris-HCl, sucrose, KCl, MgCl2, B-casein, chloroform, sodium cacodylate, tannic acid, ethanol | Sigma Aldrich | ||
Confocal microscope | nikon | spinning disk or confocal | |
Critical point dryer | Leica microsystems | CPD300 | |
Deionized water generator | MilliQ | F1CA38083B | MilliQ integral 3 |
Egg L-α-phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051 | |
Field Emission Gun SEM (FESEM) | Carl Zeiss | Gemini SEM500 | |
Glutaraldehyde 25 %, aqueous solution | Thermo Fischer scientific | 50-262-19 | |
High vacuum grease, Dow corning | VWR | ||
IMOD software | https://bio3d.colorado.edu/imod/ | software suite for tilted series image alignment and 3D reconstruction | |
Lacey Formvar/carbon electron microscopy grids | Eloise | 01883-F | |
Lipids | Avanti Polar Lipids | ||
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate | Avanti Polar Lipids | 840046 | |
Metal evaporator | Leica microsystems | EM ACE600 | |
NOA (Norland Optical Adhesives), NOA 71 and NOA 81 | Norland Products | NOA71, NOA81 | |
Osmium tetraoxyde 4% | delta microscopies | 19170 | |
Osmometer | Löser | 15 M | |
Plasma cleaner | Alcatel | pascal 2005 SD | |
Plasma generator | Electron Microscopy Science | ||
Plunge freezing equipment | leica microsystems | EMGP | |
Transmission electron microscope | Thermofischer | Tecnai G2 200 kV, LaB6 | |
Uranyl acetate | Electron Microscopy Science | 22451 | this product is not available for purchase any longer |
Wax plates, Vitrex | VWR |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved