Metodi in vitro bottom-up per saggiare l'organizzazione ultrastrutturale, il rimodellamento della membrana e il comportamento di sensibilità alla curvatura delle settine

Le settine sono proteine citoscheletriche. Interagiscono con le membrane lipidiche e possono percepire ma anche generare curvatura della membrana su scala micron. Descriviamo in questo protocollo metodologie bottom-up in vitro per l'analisi delle deformazioni della membrana, del legame della settina sensibile alla curvatura e dell'ultrastruttura del filamento di settino.

Il rimodellamento della membrana avviene costantemente a livello della membrana plasmatica e all'interno degli organelli cellulari. Per analizzare completamente il ruolo dell'ambiente (condizioni ioniche, composizioni proteiche e lipidiche, curvatura della membrana) e dei diversi partner associati a specifici processi di rimodellamento della membrana, intraprendiamo approcci bottom-up in vitro . Negli ultimi anni, c'è stato un vivo interesse nel rivelare il ruolo delle proteine della settina associate alle principali malattie. Le settine sono proteine citoscheletriche essenziali e ubiquitarie che interagiscono con la membrana plasmatica. Sono implicati nella divisione cellulare, nella motilità cellulare, nella neuro-morfogenesi e nella spermiogenesi, tra le altre funzioni. È quindi importante capire come le settine interagiscono e si organizzano a livello delle membrane per indurre successivamente deformazioni di membrana e come possono essere sensibili a specifiche curvature di membrana. Questo articolo mira a decifrare l'interazione tra l'ultra-struttura delle settine a livello molecolare e il rimodellamento della membrana che avviene su scala micron. A tal fine, il lievito in erba e i complessi di septina dei mammiferi sono stati espressi e purificati in modo ricombinante. Una combinazione di saggi in vitro è stata quindi utilizzata per analizzare l'autoassemblaggio delle settine sulla membrana. Sono stati utilizzati doppi strati lipidici supportati (SLB), vescicole unilamellari giganti (GUV), grandi vescicole unilamellari (LUV) e substrati ondulati per studiare l'interazione tra auto-assemblaggio della settina, rimodellamento della membrana e curvatura della membrana.

Le settine sono proteine che formano filamenti citoscheletrici che interagiscono con le membrane lipidiche. Le settine sono onnipresenti negli eucarioti ed essenziali per numerose funzioni cellulari. Sono stati identificati come i principali regolatori della divisione cellulare nei lieviti in erba e nei mammiferi ^1,2. Sono coinvolti negli eventi di rimodellamento della membrana, nella ciliogenesi³ e nella spermiogenesi⁴. All'interno delle cellule di mammifero, le settine possono anche interagire con actina e microtubuli ^5....

1. Determinazione del rimodellamento della membrana mediante vescicole unilamellari giganti (GUV)

NOTA: In questa sezione, i GUV sono generati per imitare le deformazioni della membrana eventualmente indotte dalle settine in un contesto cellulare. Infatti, nelle cellule, le settine si trovano frequentemente in siti con curvature micrometriche. I GUV hanno dimensioni che vanno da pochi a decine di micrometri e possono essere deformati. Sono quindi appropriati per dosare qualsiasi.......

Deformazioni dei GUV
Le tipiche immagini di fluorescenza confocale dei GUV rimodellati dopo essere stati incubati con settine sono visualizzate nella Figura 3, in condizioni in cui le settine polimerizzano. I GUV nudi (Figura 3A) erano perfettamente sferici. Dopo l'incubazione con più di 50 filamenti di settina di lievito in erba nM, le vescicole apparivano deformate. Fino a una concentrazione di ottameri settini di lievito in erba 100 nM, l.......

Come detto sopra, è stata utilizzata una miscela lipidica che migliora l'incorporazione di PI(4,5)P₂ all'interno del doppio strato lipidico e quindi facilita le interazioni settina-membrana. In effetti, abbiamo dimostrato altrove²⁵ che le settine di lievito in erba interagiscono con le vescicole in modo PI(4,5)P_2-specifico. Questa composizione lipidica è stata regolata empiricamente dallo screening di composizioni multiple ed è ora ampiamente utilizzata dagli autori. I lip.......

Ringraziamo Patricia Bassereau e Daniel Lévy per i loro utili consigli e discussioni. Questo lavoro ha beneficiato del sostegno dell'ANR (Agence Nationale de la Recherche) per il finanziamento del progetto "SEPTIME", ANR-13-JSV8-0002-01, ANR SEPTIMORF ANR-17-CE13-0014, e del progetto "SEPTSCORT", ANR-20-CE11-0014-01. B. Chauvin è finanziato dall'Ecole Doctorale "ED564: Physique en Ile de France" e dalla Fondation pour lea Recherche Médicale. K. Nakazawa è stato sostenuto dalla Sorbonne Université (AAP Emergence). G.H. Koenderink è stato sostenuto dalla Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO/OCW) attraverso il "BaSyC-Building a Synthetic Cell". So....