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Biology

セプチンの超微細構造組織、膜再形成、および曲率感度挙動をアッセイするためのボトムアップ インビトロ 法

Published: August 17th, 2022

DOI:

10.3791/63889

1Laboratoire Physico Chimie Curie, Institut Curie, PSL Research University, Sorbonne Université, 2Institut Fresnel, CNRS UMR7249, Aix Marseille Univ, Centrale Marseille, 3Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience Delft, Delft University of Technology, 4Department of Chemical Engineering, Imperial College London, 5Sorbonne Université, CNRS, Institut de Biologie Paris-Seine (IBPS), Service de microscopie électronique (IBPS-SME), 6Laboratoire Matière et Systèmes Complexes (MSC), Université Paris Cité, 7Institute of Biotechnology, Czech Academy of Sciences, BIOCEV
* These authors contributed equally

セプチンは細胞骨格タンパク質である。それらは脂質膜と相互作用し、ミクロンスケールで膜曲率を感知するだけでなく生成することもできる。このプロトコルでは、膜変形、曲率に敏感なセプチン結合、およびセプチンフィラメントの超構造を分析するためのボトムアップ インビトロ 方法論について説明します。

膜リモデリングは、原形質膜および細胞小器官内で絶えず起こる。環境(イオン条件、タンパク質および脂質組成、膜曲率)と特定の膜再形成プロセスに関連するさまざまなパートナーの役割を完全に解剖するために、in vitro ボトムアップアプローチを実施します。近年、主要な疾患に関連するセプチンタンパク質の役割を明らかにすることに強い関心が寄せられている。セプチンは、原形質膜と相互作用する必須かつ遍在する細胞骨格タンパク質である。それらは、細胞分裂、細胞運動性、神経形態形成、および精子形成、他の機能の中でも特に関与している。したがって、セプチンが膜でどのように相互作用し、組織化してその後膜変形を誘発するか、およびセプチンが特定の膜曲率にどのように敏感であるかを理解することが重要です。本稿は、分子レベルでのセプチンの超構造とミクロンスケールで起こる膜リモデリングとの相互作用を解読することを目的としている。この目的のために、出芽酵母、および哺乳動物セプチン複合体を組換え発現および精製した。次いで、 インビトロ アッセイの組み合わせを用いて、膜におけるセプチンの自己組織化を分析した。支持脂質二重層(SLB)、巨大な単層小胞(GUV)、大きな単層小胞(LUV)、および波状基質を用いて、セプチン自己組織化、膜再形成、および膜曲率の間の相互作用を研究した。

セプチンは、脂質膜と相互作用する細胞骨格フィラメント形成タンパク質である。セプチンは真核生物に遍在しており、多数の細胞機能に不可欠です。それらは、出芽酵母および哺乳動物における細胞分裂の主要な調節因子として同定されている1,2。それらは、膜再形成事象、繊毛形成3、および精子形成4に関与している。哺乳動物細胞内では、セプチンはまた、Rho GTPases(BORG)依存的に結合剤であるアクチンおよび微小管5、6、7と相互作用し得る8。様々な組織(ニューロン9、繊毛3、精子10)において、セプチンは、膜結合成分11に対する拡散障壁の調節因子として同定されている。セプチンはまた、膜ブレビングおよび突出形成12を調節することが示されている。セプチンはマルチタスク....

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1. 巨大単層小胞(GUV)を用いた膜リフォーミングの決定

注:このセクションでは、GUVは、細胞の文脈でセプチンによって誘発される可能性のある膜変形を模倣するために生成されます。実際、細胞では、セプチンはマイクロメートルの曲率を有する部位で頻繁に見出される。GUVのサイズは数マイクロメートルから数十マイクロメートルで、変形することができま?.......

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ギューブの変形
セプチンと共にインキュベートされた後に再形成されたGUVの典型的な共焦点蛍光画像は、セプチンが重合する条件下で、 図3に示されている。裸のGUV(図3A)は完全に球形であった。50nM以上の出芽酵母セプチンフィラメントとのインキュベーションにより、小胞は変形して現れた。100nMの出芽酵母セプチン八量体の濃度?.......

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上記のように、脂質二重層内のPI(4,5)P2 の取り込みを増強し、したがってセプチン - 膜相互作用を促進する脂質混合物が使用されている。実際、我々は、出芽酵母セプチンがPI(4,5 )P 2特異的な様式で小胞と相互作用することを他の25で示した。この脂質組成物は、複数の組成物をスクリーニングすることから経験的に調整され、現在、著者らによって広く使用?.......

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Patricia Bassereau と Daniel Lévy の有益なアドバイスと議論に感謝します。この作業は、プロジェクト「SEPTIME」、ANR-13-JSV8-0002-01、ANR SEPTIMORF ANR-17-CE13-0014、およびプロジェクト「SEPTSCORT」(ANR-20-CE11-0014-01)に資金を提供するためのANR(Agence Nationale de la Recherche)の支援の恩恵を受けました。B. ショーヴァンは、エコール・ドクターラーレ「ED564: Physique en Ile de France」とFondation pour lea Recherche Médicaleから資金提供を受けています。中澤圭吾はソルボンヌ大学(AAP Emergence)の支援を受けた。G.H. Koenderinkは、Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek(NWO/OCW)の「BaSyC-Building a Synthetic Cell」を通じて支援を受けた。重力グラント(024.003.019).Labex Cell(n)Scale (ANR-11-LABX0038) と Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02) に感謝します。我々は、フランス国立研究インフラフランスバイオイメージング(ANR10-INBS-04)のメンバーである細胞組織イメージング(PI....

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NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamineAvanti Polar Lipids850725
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serineAvanti Polar Lipids840035
Bath sonicatorElmaElmasonic S10H
Bodipy-TR-Ceramideinvitrogen, Thermo Fischer scientific11504726
Chemicals: NaCl, Tris-HCl, sucrose, KCl, MgCl2, B-casein, chloroform, sodium cacodylate, tannic acid, ethanolSigma Aldrich
Confocal microscopenikonspinning disk or confocal
Critical point dryerLeica microsystemsCPD300
Deionized water generatorMilliQF1CA38083BMilliQ integral 3
Egg L-α-phosphatidylcholineAvanti Polar Lipids840051
Field Emission Gun SEM (FESEM)Carl ZeissGemini SEM500
Glutaraldehyde 25 %, aqueous solutionThermo Fischer scientific50-262-19
High vacuum grease, Dow corningVWR
IMOD softwarehttps://bio3d.colorado.edu/imod/software suite for tilted series image alignment and 3D reconstruction
Lacey Formvar/carbon electron microscopy gridsEloise01883-F
LipidsAvanti Polar Lipids
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphateAvanti Polar Lipids840046
Metal evaporatorLeica microsystemsEM ACE600
NOA (Norland Optical Adhesives), NOA 71 and NOA 81Norland ProductsNOA71, NOA81
Osmium tetraoxyde 4%delta microscopies19170
OsmometerLöser15 M
Plasma cleanerAlcatelpascal 2005 SD
Plasma generatorElectron Microscopy Science
Plunge freezing equipmentleica microsystemsEMGP
Transmission electron microscopeThermofischerTecnai G2 200 kV, LaB6
Uranyl acetateElectron Microscopy Science22451this product is not available for purchase any longer
Wax plates, VitrexVWR

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