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Biology

Bottom-Up In Vitro Methods to assay the Ultrastructural Organization, Membrane Reshaping, and Curvature Sensitivity Behavior of Septins

Published: August 17th, 2022

DOI:

10.3791/63889

1Laboratoire Physico Chimie Curie, Institut Curie, PSL Research University, Sorbonne Université, 2Institut Fresnel, CNRS UMR7249, Aix Marseille Univ, Centrale Marseille, 3Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience Delft, Delft University of Technology, 4Department of Chemical Engineering, Imperial College London, 5Sorbonne Université, CNRS, Institut de Biologie Paris-Seine (IBPS), Service de microscopie électronique (IBPS-SME), 6Laboratoire Matière et Systèmes Complexes (MSC), Université Paris Cité, 7Institute of Biotechnology, Czech Academy of Sciences, BIOCEV
* These authors contributed equally

셉틴은 세포골격 단백질이다. 그들은 지질 막과 상호 작용하고 미크론 규모에서 막 곡률을 감지 할 수 있습니다. 우리는 막 변형, 곡률에 민감한 셉틴 결합 및 셉틴 필라멘트 초 구조를 분석하기위한 상향식 시험관 내 방법론을 설명합니다.

막 리모델링은 원형질막과 세포 소기관 내에서 지속적으로 발생합니다. 환경 (이온 조건, 단백질 및 지질 조성물, 막 곡률)과 특정 막 재구성 과정과 관련된 다양한 파트너의 역할을 완전히 해부하기 위해 우리는 시험관 내 상향식 접근법을 수행합니다. 최근 몇 년 동안, 주요 질병과 관련된 셉틴 단백질의 역할을 밝히는 데 관심이 높아지고 있습니다. 셉틴은 원형질막과 상호작용하는 필수적이고 유비쿼터스 세포골격 단백질이다. 그들은 다른 기능들 중에서도 세포 분열, 세포 운동성, 신경 형태 형성 및 정자 형성에 연루되어 있습니다. 따라서 셉틴이 멤브레인에서 어떻게 상호 작용하고 조직되어 멤브레인 변형을 유도하고 특정 막 곡률에 어떻게 민감 할 수 있는지 이해하는 것이 중요합니다. 이 기사는 분자 수준에서 셉틴의 초 구조와 미크론 규모로 발생하는 막 리모델링 사이의 상호 작용을 해독하는 것을 목표로합니다. 이를 위해, 싹트는 효모 및 포유동물 셉틴 복합체를 재조합적으로 발현하고 정제하였다. 이어서 , 시험관내 분석의 조합을 사용하여 막에서 셉틴의 자가조립을 분석하였다. 지지된 지질 이중층(SLBs), 거대한 유니라멜라 소포(GUVs), 큰 유니라멜라 소포(LUVs) 및 물결 모양의 기질을 사용하여 셉틴 자가조립, 막 재구성 및 막 곡률 사이의 상호작용을 연구하였다.

셉틴은 지질막과 상호작용하는 세포골격 필라멘트 형성 단백질이다. 셉틴은 진핵생물에서 유비쿼터스이며 수많은 세포 기능에 필수적입니다. 이들은 신진 효모 및 포유류 1,2에서 세포 분열의 주요 조절자로 확인되었다. 그들은 막 재형성 사건, ciliogenesis3 및 정자 생성4에 관여합니다. 포유동물 세포 내에서, 셉틴은 또한 Rho GTPases (BORG)-의존성 방식8의 결합제에서 액틴 및 미세소관 5,6,7과 상호작용할 수 있다. 다양한 조직(뉴런9, 섬모3, 정자10)에서, 셉틴은 막 결합 성분(11)에 대한 확산 장벽의 조절자로서 확인되었다. 셉틴은 또한 막 블링 및 돌출부 형성(12....

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1. 거대한 유니라멜라 소포(GUV)를 이용한 막 재성형 결정

참고: 이 섹션에서 GUV는 세포 맥락에서 셉틴에 의해 유도될 가능성이 있는 막 변형을 모방하기 위해 생성된다. 실제로, 세포에서, 셉틴은 마이크로미터 곡률을 가진 부위에서 자주 발견된다. GUV는 몇 마이크로미터에서 수십 마이크로미터에 이르는 크기를 가지며 변형될 수 있습니다. 따라서 이들은 임의의 마.......

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GUV 변형
셉틴과 함께 인큐베이션된 후 재성형된 GUVs의 전형적인 공초점 형광 이미지는 셉틴이 중합되는 조건에서 도 3에 표시된다. 베어 GUV(그림 3A)는 완벽하게 구형이었다. 50 nM 이상의 신진 효모 셉틴 필라멘트와 함께 인큐베이션시, 소포는 변형된 것처럼 보였다. 최대 100 nM 농도의 싹이 트인 효모 셉틴 옥타머까지, 소포는 패싯된 것처?.......

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상기 언급된 바와 같이, 지질 혼합물이 지질 이중층 내에 PI(4,5)P2 혼입을 강화하고 따라서 셉틴-막 상호작용을 용이하게 하는 데 사용되었다. 실제로, 우리는 다른 곳에서 신진 효모 셉틴이 PI (4,5 ) P 2 특정 방식으로 소포와 상호 작용한다는 것을 다른곳에서 보여주었습니다. 이 지질 조성물은 다수의 조성물을 스크리닝하는 것으로부터 경험적으로 조정되었고, 현.......

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Patricia Bassereau와 Daniel Lévy에게 유용한 조언과 토론에 감사드립니다. 이 작업은 프로젝트 "SEPTIME", ANR-13-JSV8-0002-01, ANR SEPTIMORF ANR-17-CE13-0014 및 프로젝트 "SEPTSCORT", ANR-20-CE11-0014-01에 자금을 지원하기위한 ANR (Agence Nationale de la Recherche)의 지원으로부터 이익을 얻었습니다. B. Chauvin은 Ecole Doctorale "ED564 : Physique en Ile de France"와 Fondation pour lea Recherche Médicale이 자금을 지원합니다. K. Nakazawa는 Sorbonne Université (AAP Emergence)의 지원을 받았습니다. G.H. Koenderink는 'BaSyC-Building a Synthetic Cell'을 통해 Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO/OCW)의 지원을 받았습니다. 중력 교부금(024.003.019). Labex Cell(n)Scale (ANR-11-LABX0038)과 Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02)에 감사드립니다. 프랑스 국립 연구 인프라....

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NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamineAvanti Polar Lipids850725
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serineAvanti Polar Lipids840035
Bath sonicatorElmaElmasonic S10H
Bodipy-TR-Ceramideinvitrogen, Thermo Fischer scientific11504726
Chemicals: NaCl, Tris-HCl, sucrose, KCl, MgCl2, B-casein, chloroform, sodium cacodylate, tannic acid, ethanolSigma Aldrich
Confocal microscopenikonspinning disk or confocal
Critical point dryerLeica microsystemsCPD300
Deionized water generatorMilliQF1CA38083BMilliQ integral 3
Egg L-α-phosphatidylcholineAvanti Polar Lipids840051
Field Emission Gun SEM (FESEM)Carl ZeissGemini SEM500
Glutaraldehyde 25 %, aqueous solutionThermo Fischer scientific50-262-19
High vacuum grease, Dow corningVWR
IMOD softwarehttps://bio3d.colorado.edu/imod/software suite for tilted series image alignment and 3D reconstruction
Lacey Formvar/carbon electron microscopy gridsEloise01883-F
LipidsAvanti Polar Lipids
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphateAvanti Polar Lipids840046
Metal evaporatorLeica microsystemsEM ACE600
NOA (Norland Optical Adhesives), NOA 71 and NOA 81Norland ProductsNOA71, NOA81
Osmium tetraoxyde 4%delta microscopies19170
OsmometerLöser15 M
Plasma cleanerAlcatelpascal 2005 SD
Plasma generatorElectron Microscopy Science
Plunge freezing equipmentleica microsystemsEMGP
Transmission electron microscopeThermofischerTecnai G2 200 kV, LaB6
Uranyl acetateElectron Microscopy Science22451this product is not available for purchase any longer
Wax plates, VitrexVWR

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