Bottom-Up In Vitro-metoder for å analysere den ultrastrukturelle organisasjonen, membranomformingen og krumningsfølsomhetsoppførselen til septiner

Septiner er cytoskeletale proteiner. De samhandler med lipidmembraner og kan fornemme, men også generere membrankrumning på mikronskalaen. Vi beskriver i denne protokollen bottom-up in vitro metoder for analyse av membrandeformasjoner, krumningsfølsom septinbinding og septinfilament ultrastruktur.

Membranremodellering skjer konstant ved plasmamembranen og i cellulære organeller. For å fullstendig dissekere miljøets rolle (ioniske forhold, protein- og lipidsammensetninger, membrankrumning) og de forskjellige partnerne knyttet til spesifikke membranomformingsprosesser, foretar vi in vitro bottom-up-tilnærminger. I de senere år har det vært stor interesse for å avsløre rollen som septinproteiner assosiert med store sykdommer. Septiner er essensielle og allestedsnærværende cytoskeletale proteiner som interagerer med plasmamembranen. De er involvert i celledeling, cellemotilitet, nevromorfogenese og spermiogenese, blant andre funksjoner. Det er derfor viktig å forstå hvordan septiner interagerer og organiserer seg ved membraner for senere å indusere membrandeformasjoner og hvordan de kan være følsomme for spesifikke membrankrumninger. Denne artikkelen tar sikte på å dechiffrere samspillet mellom ultrastrukturen til septiner på molekylært nivå og membranremodellering som forekommer på mikronskala. Til dette formål ble spirende gjær og pattedyr septinkomplekser rekombinant uttrykt og renset. En kombinasjon av in vitro-analyser ble deretter brukt til å analysere selvmontering av septiner ved membranen. Støttede lipid dobbeltlag (SLBer), gigantiske unilamellære vesikler (GUV), store unilamellære vesikler (LUV) og bølgete substrater ble brukt til å studere samspillet mellom septin selvmontering, membranomforming og membrankrumning.

Septiner er cytoskeletale filamentdannende proteiner som interagerer med lipidmembraner. Septiner er allestedsnærværende i eukaryoter og essensielle for mange cellulære funksjoner. De har blitt identifisert som de viktigste regulatorene for celledeling i spirende gjær og pattedyr ^1,2. De er involvert i membranomformingshendelser, ciliogenese³ og spermiogenese⁴. I pattedyrceller kan septiner også interagere med aktin og mikrotubuli ^5,6,7 i et bindemiddel av R....

1. Bestemmelse av membranomforming ved hjelp av gigantiske unilamellære vesikler (GUV)

MERK: I denne delen genereres GUV for å etterligne membrandeformasjonene som muligens induseres av septiner i en cellulær sammenheng. Faktisk, i celler, er septiner ofte funnet på steder med mikrometer krumninger. GUV har størrelser fra noen få til titalls mikrometer og kan deformeres. De er derfor hensiktsmessige for å analysere eventuelle septininduserte deformasjoner i mikrometerskal.......

GUVs deformasjoner
Typiske konfokale fluorescensbilder av GUV-er omformet etter å ha blitt inkubert med septiner vises i figur 3, under forhold der septiner polymeriseres. Bare GUVs (figur 3A) var perfekt sfæriske. Ved inkubasjon med mer enn 50 nM spirende gjærseptinfilamenter virket vesiklene deformerte. Opp til en konsentrasjon på 100 nM spirende gjærseptinoktamerer syntes vesiklene fasetterte, og deformasjonene forble statiske og svin.......

Som nevnt ovenfor har en lipidblanding blitt brukt som forbedrer PI (4,5) P 2-inkorporering i lipid-dobbeltlaget og dermed letter septinmembraninteraksjoner. Faktisk har vi vist andre steder²⁵ at spirende gjærseptiner samhandler med vesikler på en PI (4,5) P_2-spesifikk måte. Denne lipidsammensetningen ble justert empirisk fra screening av flere komposisjoner og er nå mye brukt av forfatterne. PI (4,5) P₂ lipider må håndteres nøye. Stamløsninger må aliquote.......

Vi takker Patricia Bassereau og Daniel Lévy for nyttige råd og diskusjoner. Dette arbeidet dro nytte av støtte fra ANR (Agence Nationale de la Recherche) for finansiering av prosjektet "SEPTIME", ANR-13-JSV8-0002-01, ANR SEPTIMORF ANR-17-CE13-0014, og prosjektet "SEPTSCORT", ANR-20-CE11-0014-01. B. Chauvin er finansiert av Ecole Doctorale "ED564: Physique en Ile de France" og Fondation pour lea Recherche Médicale. K. Nakazawa ble støttet av Sorbonne Université (AAP Emergence). G.H. Koenderink ble støttet av Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO/OCW) gjennom 'BaSyC-Building a Synthetic Cell'. Gravitasjonsstipend (024.003.019). Vi takker Labex Cel....